靶向SOCS3的microRNAs對HCV復(fù)制的影響及機(jī)制探討.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)主要通過血液途徑感染肝臟，引起急性及慢性病毒性肝炎。目前全球約有1.7～2億人感染HCV，中國健康人群HCV抗體陽性率為0.7％～3.1％。大多數(shù)HCV感染易演變?yōu)槁愿腥荆糠諬CV慢性感染可進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌。HCV感染已成為危害健康的嚴(yán)重問題。聚乙二醇α干擾素(pegylated interferon-α，PEG-IFN-α)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)是

2、目前抗HCV感染的經(jīng)典治療方案，但由于IFN嚴(yán)重的毒副作用、不同HCV基因型敏感性不同、干擾素抵抗等多種因素限制了其療效及使用范圍。近年來，隨著對HCV不斷深入的研究，抗HCV治療方面取得較大成果，如抗HCV的小分子藥物蛋白酶抑制劑——直接抗病毒藥物(direct-acting antiviral agents，DAAs)的臨床應(yīng)用，相較于聯(lián)合療法持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)明

3、顯提高。但由于HCV基因型多、易變異且DAA治療費(fèi)用昂貴等應(yīng)用受限，且近期有報(bào)道DAAs可能會(huì)增加肝細(xì)胞癌的發(fā)病率及術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，對HCV感染相關(guān)宿主因子的探索及靶向抗HCV治療仍是目前HCV研究的熱點(diǎn)。
　　HCV是單股正鏈RNA病毒，為黃病毒屬成員，多個(gè)宿主因子被報(bào)道參與包括入侵、復(fù)制、組裝和釋放等在內(nèi)的復(fù)制周期。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA。大量研究表明，miRNAs可參與調(diào)控細(xì)胞分化、

4、增殖、凋亡、代謝、細(xì)胞周期等多個(gè)環(huán)節(jié)，并與炎癥性、感染性、代謝性疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其主要生物學(xué)功能是通過與其靶標(biāo)分子的3'-UTR結(jié)合來抑制翻譯或降解mRNA，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。多種miRNAs已被證實(shí)在HCV誘導(dǎo)的肝癌(HCV-HCC)的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。miRNAs在HCV的復(fù)制、診斷、治療中同樣扮演重要角色。例如，研究發(fā)現(xiàn)miR-122及miR-141具有促進(jìn)HCV復(fù)制的作用，miR-122的小分子互

5、補(bǔ)拮抗劑Miravirsen(SPC3649)目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。
　　細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一，大量研究表明SOCS3在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)SOCS3可以負(fù)性調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和激素（包括IL-6、IL-10、IFN-α、LPS、瘦素、胰島素等）產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)，從而在炎癥、感染及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。SOCS3在病毒感染中的作用主要與其

6、可負(fù)性調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)通路有關(guān)，而JAK-STATs通路是Ⅰ型和Ⅱ型IFN發(fā)揮抗病毒作用的信號通路。SOCS3的表達(dá)與HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制程度密切相關(guān)。已有研究表明，HCV患者肝樣本中SOCS3蛋白表達(dá)增加，而高水平SOCS3表達(dá)與HCV患者IFN治療抵抗相關(guān)。同時(shí)，肝細(xì)胞

7、SOCS3水平可反應(yīng)HCV感染IFN治療的效果。SOCS3基因的多態(tài)性與宿主對抗病毒治療的反應(yīng)相關(guān)。已有報(bào)道表明SOCS3是HCV在體內(nèi)復(fù)制中重要的宿主因子之一，近年來的研究表明多種miRNA可通過調(diào)節(jié)SOCS3的表達(dá)而影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展，但鮮有靶向SOCS3的miRNAs對HCV復(fù)制及IFN抗HCV作用的影響?；赟OCS3在HCV復(fù)制中的重要作用，本課題探討了靶向SOCS3的miRNAs對HCV復(fù)制及IFN抗HCV作用的影響。<

8、br>　　本研究中，首先通過SOCS3的siRNA驗(yàn)證了SOCS3在細(xì)胞水平對HCV復(fù)制的影響:將si-SOCS3及si-NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，相較于si-NC，si-SOCS3除可抑制HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，IFN-α還可進(jìn)一步增強(qiáng)si-SOCS3對HCV復(fù)制的抑制作用。進(jìn)而，以mimicNC(mNC)作為陽性對照，通過轉(zhuǎn)染miRNA mimic模擬miRNA在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)，證實(shí)了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-3

9、0c-5p對SOCS3具有明顯的抑制作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建含有SOCS33'-UTR(WT)及miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p與SOCS33'-UTR結(jié)合位點(diǎn)突變的質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證了SOCS3是miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p的靶標(biāo)分子。在此基礎(chǔ)上，通過利用HCVcc感染，在細(xì)胞模型上證實(shí)了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p

10、在抑制HCV復(fù)制的同時(shí)也抑制了SOCS3的表達(dá)。而在用IFN-α處理后，miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p對HCV復(fù)制的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。以往的研究已證實(shí)SOCS3是JAK-STATs通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一，而IFN-α抗HCV的作用正是通過作用于JAK-STATs通路，IFN-α上調(diào)該通路下游p-STAT1的表達(dá)發(fā)揮其抗HCV的作用。因此，分別轉(zhuǎn)染si-SOCS3、miR-185-5p mimic、

11、miR-19b-3p mimic、miR-30c-5p mimic及對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對照，si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic及miR-30c-5p mimic均可明顯上調(diào)p-STAT1的表達(dá)，從而進(jìn)一步證實(shí)了IFN-α增強(qiáng)靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p抑制HCV復(fù)制的作用是通過共同加強(qiáng)JAK-STATs通路作用而實(shí)現(xiàn)的。
　　

12、基于上述發(fā)現(xiàn)，靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p可在細(xì)胞模型中抑制HCV復(fù)制，其作用是通過互補(bǔ)結(jié)合SOCS3mRNA的3'-UTR抑制了SOCS3蛋白的表達(dá)。這一抑制作用解除或削弱了SOCS3對JAK-STAT通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，明顯上調(diào)了p-STAT1的表達(dá)，而p-STAT1是IFN-α發(fā)揮抗HCV效應(yīng)的中介因子之一。因此，靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR