Rln3a在尼羅羅非魚精子發(fā)生過程的作用及分子機制研究.pdf

1、松弛素家族在生殖學領域受到關注，哺乳類RLN3是一種新型的松弛素家族成員，在腦和睪丸中表達。迄今為止，關于RLN3生物學功能的報道，主要作為一種神經肽參與腦部的神經調節(jié)：如應激反應、激勵、主動性、調節(jié)攝食活動等。小鼠的RLN3基因敲除導致其焦躁不安，憂慮多動，因而RLN3長期以來作為一種神經肽，治療神經疾病，如抑郁癥等。硬骨魚類出現了rln3復制基因：rln3a和rln3b，其中rln3a是脊椎動物中rln3的直系同源基因，本課題組的前

2、期研究基礎表明rln3a在羅非魚腦和精巢中有較高的表達水平，但迄今為止未見關于rln3參與脊椎動物生殖調控的報道。為了揭示rln3a在硬骨魚類精子發(fā)生過程中的作用，本研究以尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）為實驗對象，設計了一系列的實驗進行證明。羅非魚是重要的世界性養(yǎng)殖魚類，它的性別決定類型是XX和XY型，其單性魚苗很容易獲得，我們實驗室已完成對羅非魚性別分化不同發(fā)育時期（孵化后5、30、90、180天）雌雄性腺的

3、轉錄組測序，深入研究了類固醇激素（11-KT和DHP）、生長因子（IGF3和AMH等）、轉錄因子（Dmrt1和Sf1等）對羅非魚精子發(fā)生過程的調控，建立了羅非魚的基因敲除平臺，這些工作使得羅非魚成為研究硬骨魚類育性的良好實驗動物。在本研究中，我們在獲得rln3a突變F0代個體的基礎上，篩選到F1代rln3a的突變個體，深入研究該基因突變影響精巢分化、精子發(fā)生的分子機制。首先通過免疫組化、H.E.染色、流式細胞儀和電鏡等方法研究了rln3

4、a突變對精巢組織結構、精子發(fā)生和育性等過程的影響。其次，分別對rln3a突變個體和對照魚的腦和性腺組織進行轉錄組分析，在腦和性腺中篩選出一系列顯著差異表達基因。最后通過Real-time PCR和免疫組化驗證了rln3a突變前后這些基因在性腺中的表達模式，闡明了rln3a影響羅非魚精子發(fā)生的分子機制。我們得出的研究結果歸納如下：
　　1）對已獲得的F0代rln3a基因突變個體飼養(yǎng)至性成熟，通過F0代突變雄性個體與正常雌性個體受精得

5、到F1代。運用H.E.染色對3月齡F1代rln3a基因突變的羅非魚個體進行組織學觀察，結果發(fā)現rln3a基因突變個體的性腺中精子發(fā)生啟動延遲，與對照組相比未發(fā)現初級和次級精母細胞等各級生精細胞。免疫組化實驗未檢測到雄激素（Cytochrome P450, family11, subfamily C, polypeptide1，11-KT）合成酶（Cyp11b2）的表達。另外，通過抗增殖細胞核抗原（PCNA）染色發(fā)現在rln3a突變的精巢

6、中的表達水平顯著低于對照組的精巢。因此，我們推測rln3a基因的突變影響羅非魚精子發(fā)生的啟動和精原細胞的增殖。
　　2）通過H.E.染色發(fā)現rln3a基因突變成魚的精巢精小葉紊亂，幾乎未見精子細胞和成熟精子。通過掃描電鏡發(fā)現rln3a基因突變個體的精巢出現空腔，精巢的橫切面積和精子數量顯著低于對照組。通過透射電鏡發(fā)現在rln3a基因突變魚的性腺中未發(fā)現成熟精子，但與對照組個體相比，rln3a基因突變魚未影響精巢中精母細胞的分化。<

7、br>　　3）通過F1代rln3a基因突變成魚與正常XX個體受精實驗發(fā)現，胚胎到受精后2天（囊胚期）幾乎全部死亡，表明rln3a基因突變個體不能正常受精。分別取rln3a基因突變魚和正常羅非魚的精液，用流式細胞儀和電腦輔助的精子分析儀進行相應的測定，發(fā)現rln3a基因突變個體的精子體積(FSC)和細胞內復雜程度(SSC)顯著低于對照組。精子活力測定結果顯示，rln3a基因突變個體的精子活力相關參數（平均直線、曲線運動速度、精子活力、精子

8、濃度）顯著低于對照組。通過對血清中激素水平的測定發(fā)現，rln3a基因突變個體血清中11-KT、FSH和LH的水平顯著低于對照組XY個體。
　　4）為了進一步研究rln3a基因突變對羅非魚個體的影響，我們分別對rln3a基因突變和對照組個體的腦和性腺進行轉錄組測序。在腦和性腺中篩選出rln3a基因突變前后顯著差異表達的基因，并且對這些差異表達基因進行GO和KEGG的分析。最后通過Real-time PCR驗證了這些基因在rln3a基