缺血再灌注腎損傷的代謝組學及飽和氫生理鹽水對其保護作用的研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI）是一組臨床常見的突發(fā)性腎功能受損，據(jù)不同研究報道其發(fā)生率可高達5％-30％。目前常用的AKI 診斷標準為：腎功能在48小時內突然減退，表現(xiàn)為血肌酐升高≥26.4|ìmol/l 或較基礎值上升≥50％；或尿量＜
　　 5ml/kg/h 超過6小時。然而血肌酐受到年齡、性別、體重等多個因素的影響，且靈敏度較差，因此尋找其他更特具特異性和敏感性的AKI 標志物，是近年來學者們

2、的研究熱點。代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學等之后發(fā)展起來的以探討機體整體代謝狀態(tài)為目標的新方法，是指通過分析生物的體液和組織中的內源性代謝產(chǎn)物、代謝組或代謝物圖譜的變化來研究整體的生理或病理情況下的代謝狀況。本研究將SD大鼠分為假手術對照組(對照組)、缺血再灌注腎損傷組(損傷組)和左旋卡尼汀干預的缺血再灌注腎損傷組(治療組)，收集三組大鼠在術后不同時間點的血清進行代謝產(chǎn)物分析，以評估代謝組學能否早期發(fā)現(xiàn)AKI，進一步探索AKI的發(fā)病機

3、制并尋找新的診斷生物標記物。
　　 利用高分辨率液相色譜/四級桿-飛行時間-質譜串聯(lián)(rapid resolution liquidchromatography/quadrupole-time of flight-mass spectrometer，RRLC/Q-TOF-MS）技術分析樣品，產(chǎn)生的得分圖于缺血再灌注后2小時即可區(qū)分對照組、損傷組和治療組，早于血清肌酐和尿素氮的變化，載荷圖則能顯示區(qū)分三組大鼠的代謝物的分子量，經(jīng)過

4、二級質譜比對，最終確定有28種物質作為差異性代謝產(chǎn)物可以很好的區(qū)分三組大鼠，這些物質主要包括溶血卵磷脂、游離脂肪酸、卡尼汀及其衍生物、氨基酸和肽類等。損傷組大鼠血清中，溶血卵磷脂、游離脂肪酸和硝基化酪氨酸比對照組顯著升高(p＜0.05)，卡尼汀和乙?？嵬『縿t較對照組降低(p＜0.05)，而治療組的溶血卵磷脂、游離脂肪酸和硝基化酪氨酸相比損傷組，則有明顯下調(p＜0.05)，卡尼汀和乙酰卡尼汀含量則顯著升高(p＜0.05)。溶血卵磷脂

5、和游離脂肪酸是磷脂酰膽堿經(jīng)磷脂酶A2 (PLA2)的水解產(chǎn)物，前者含量的升高提示PLA2 活性的升高；卡尼汀和乙?？嵬〉慕档蛣t提示缺血再灌注時能量的缺乏；硝基化酪氨酸作為蛋白質的硝基化產(chǎn)物，它的水平可以反映組織氧化應激的水平，因此損傷組中硝基化酪氨酸的升高提示氧化應激水平的升高。為了驗證代謝組學的結果，我們進一步檢測了腎組織的MDA水平、SOD和PLA2的活性，結果顯示損傷組大鼠血清sPLA2 活性和腎組織cPLA2 活性均較對照組顯

6、著升高，MDA水平也升高，而SOD 活性降低。經(jīng)卡尼汀治療后上述變化得到顯著減輕。綜上所述，代謝組學分析發(fā)現(xiàn)了大鼠血清中28種物質的變化與缺血再灌注腎損傷有關，并且說明其發(fā)病機制與能量代謝障礙導致的脂質異常和氧化應激有關，給予損傷大鼠左旋卡尼汀可以通過改善能量代謝，進而改善脂質異常和氧化應激來減輕缺血再灌注腎損傷。
　　 代謝組學研究證實氧化應激是導致缺血再灌腎損傷的重要原因之一，因此減輕氧化應激是保護腎功能的重要途徑。但許多抗

7、氧化物質的臨床實驗效果并不理想，有的是因為不能通過細胞膜等生物屏障，有的則是由于清除了許多具有重要生理作用的活性氧自由基，例如過氧化氫和一氧化氮。氫氣作為自然界分子量最低的氣體，由于能結合羥自由基而具有明確的抗氧化作用，目前已用于治療缺血再灌注引起的腦損傷、心臟損傷、小腸損傷及肝臟損傷等動物模型，均取得了很好的效果，并且實驗證實氫氣抗自由基具有很強的特異性，只選擇性地與羥自由基和過氧亞硝基陰離子這些毒性強的自由基反應，而不影響其他自由基

8、的正常生理功能。我們的實驗即是為了研究氫氣對缺血再灌注腎損傷是否同樣具有保護作用，并且進一步研究其可能的作用機制。
　　 將SD大鼠分為假手術對照組（對照組）、缺血再灌注腎損傷組（損傷組）和不同劑量和時間飽和氫生理鹽水（saturated hydrogen saline, SHS）干預的缺血再灌注腎損傷組（治療組），缺血再灌注24小時后處死大鼠，留取血清樣本檢測BUN和Scr、留取腎組織進行HE、PAS和TUNEL 染色，檢測腎

9、組織MDA水平和SOD 活性，免疫組化檢測3-nitrotyrosine、8-OH-dG的表達，western blot 檢測oxyblot的表達。藥效學實驗證實，于再灌注前30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予0.5ml/100g的SHS，可以發(fā)揮最好的腎功能保護作用，并減輕小管上皮細胞的凋亡和組織學損傷，再灌前30分鐘靜脈注射SHS 超過0.5ml/100g時，繼續(xù)增加給藥劑量并不能再減輕腎臟損傷，而再灌注后30分鐘給予相同劑量SHS對腎功能無明

10、顯保護作用(p＞0.05)。SHS 療效最佳組與損傷組相比，BUN和Scr 顯著降低，腎組織MDA水平降低，SOD 活性升高，3-nitrotyrosine、8-OH-dG表達減少，oxyblot表達也顯著降低(以上p 均＜0.05）。這些結果說明，SHS 可通過減輕氧化應激來減輕缺血再灌注腎損傷。
　　 近來許多研究證實，器官缺血再灌注損傷除了與氧化應激有關，內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress

11、，ERS）導致的細胞凋亡也發(fā)揮了重要的作用。內質網(wǎng)具有蛋白質的合成、修飾，類固醇、脂質、糖原合成，鈣的儲存及鈣穩(wěn)態(tài)的維持等多種功能。缺血、缺氧、感染等因素均可以干擾內質網(wǎng)的功能，破壞其穩(wěn)態(tài)，當內質網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白增多時,應激信號通過內質網(wǎng)膜傳遞到細胞核中，引發(fā)未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)導致細胞的凋亡。由于活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）可以

12、誘發(fā)ERS，而氫可以顯著減少ROS，因此我們推測氫也可以減輕缺血再灌注腎損傷時的ERS。為了驗證這一推測，我們用westernblot 檢測了三組大鼠腎組織的內質網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78和凋亡蛋白CHOP、caspase12的表達，以及UPR 凋亡通路中的eIF2 α和PERK的表達。結果顯示，損傷組內質網(wǎng)應激相關蛋白的表達較對照組顯著升高(p＜0.05)，而再灌注前30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予0.5ml/100gSHS的治療組，GRP78

13、和CHOP的表達比未治療的損傷組顯著下降，caspase12的活化、eIF2|á和PERK的磷酸化也明顯降低(p＜0.05)。
　　 綜上所述，代謝組學分析能夠早于腎功能的變化發(fā)現(xiàn)缺血再灌注腎損傷，其差異性代謝產(chǎn)物主要包括溶血卵磷脂、游離脂肪酸、卡尼汀及其衍生物、氨基酸和肽類等。
　　 進一步通過檢測相關酶活性來驗證代謝組學的結果，二者結合說明缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機制可能與能量代謝障礙導致的氧化應激和脂質異常有關。于再