重組CTLA4-Ig融合蛋白的糖基化修飾分析及其對穩(wěn)定性和功能影響的研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見的免疫系統(tǒng)紊亂性疾病之一，常常引起關節(jié)疼痛、腫脹以及全身性慢性疾病，全球大約有2千萬患者。T細胞在這一過程中發(fā)揮了關鍵性的作用，抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)通過主要組織相容性復合體(major histo-compatibility complex，MHC)和免疫共刺激分子雙信號激活T細胞，通過信號級聯(lián)反應促進多種細胞因子，如

2、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）和干擾素(interferon，IFN)等的釋放，從而導致骨骼、關節(jié)等組織的損傷。常用藥物為Adalimumab(ADA)，Etanercept(ETN)，Infliximab(IFX)，Rituximab(RTX)，Tocilizumab(TOC)以及Abatacept(ABT)。它們的作用機理主要分為兩類:其一，

3、針對級聯(lián)反應終末期的細胞因子，阻斷其發(fā)揮生物學功能，從而減少骨骼、關節(jié)等組織的損傷，如ADA、ETN、IFX等;其二，針對反應的啟動階段，阻止T細胞的激活，從而在源頭阻斷免疫級聯(lián)反應的發(fā)生，其典型代表為ABT。ABT在2005年被FDA批準用于治療頑固性RA，已經過十余年的臨床應用，安全性和有效性獲得確認。
　　本文的研究對象，ABT是一個融合蛋白，又叫CTLA4-Ig，由細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T-ly

4、mphocyte-associated antigen4，CTLA4)的胞外段和修飾的IgG1抗體Fc（鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)2和恒定區(qū)3）組成。其通過CTLA4與APC上的白細胞分化抗原80（cluster of differentiation80，CD80，B7-1）或者白細胞分化抗原86(cluster ofdifferentiation86，CD86，B7-2)結合競爭T細胞上的CD28，從而阻斷T細胞的活化，進而抑制免疫級聯(lián)反應，導致

5、IL和TNFα等細胞因子釋放減少，這些細胞因子在RA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了非常重要的作用。因而，ABT在RA的治療中獲得了良好的效果。
　　相比小分子化學藥物，蛋白類藥物具有明顯的自身優(yōu)勢，比如特異性好，副作用低，體內靶向分布，并且能夠通過多種途徑發(fā)揮治療作用。但是，由于蛋白類藥物都是在哺乳動物細胞內表達、分子量大、結構復雜、含大量的翻后修飾，以及生產工藝復雜等特點，使得制藥公司在對其進行質量研究及產品放行的難度加大。大量的研究發(fā)

6、現(xiàn)翻譯后修飾對蛋白質的結構和功能具有重要的影響，例如抗體類藥物Fc上的N糖，除了對抗體的抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)具有重要的影響外，還對抗體的結構、穩(wěn)定性及酶的敏感性方面也具有重要影響。而CTLA4-Ig作為融合蛋白既有可結晶片

7、段（crystallizable fragment，F(xiàn)c）部分，也有CTLA-4胞外段，這兩部分都存在復雜的糖基化修飾。雖然FDA在2005年就已批準用于臨床，但是對其糖基化修飾研究報道很少，并且其還存在復雜的O-糖基化修飾;再者糖基化修飾對其結構、穩(wěn)定性和功能影響的研究未見報道。本課題詳細表征CTLA4-Ig融合蛋白的糖基化修飾，進而明確這些糖基化修飾與其穩(wěn)定性和功能間的關系，為CTLA4-Ig融合蛋白的質量控制提供參考，同時為CTL

8、A4-Ig生物類似藥研究打下基礎。
　　本課題采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜(ultra performance liquidchromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight, UPLC-ESI-Q-ToF)、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry, DSC）、分子排阻色譜(size exclusio

9、n chromatography，SEC)、差示掃描熒光(differential scanning fluoroscopy，DSF)、ForteBio結合活性，以及細胞生物學活性等技術，從糖基化修飾水平對CTLA4-Ig融合蛋白進行了全面的表征分析;并通過應用多種酶對CTLA4-Ig融合蛋白進行處理，在此基礎之上，應用多種檢測手段對CTLA4-Ig融合蛋白的穩(wěn)定性和功能進行了研究。具體研究路線如下:
　　糖基化修飾表征分析部分:

10、在完整蛋白水平，因CTLA4-Ig融合蛋白含有多個N-糖基化和O-糖基化修飾，質譜無法獲得有效信息;在亞單位水平，為了降低蛋白的復雜性以獲得更加詳盡的信息，我們應用了多種酶（PNGase F、EndoF2、Neuraminidase和O-Glycosidase）對樣品進行處理，然后應用質譜進行檢測;在質量肽圖譜水平，通過胰酶對樣品進行處理后，應用質譜進行檢測;在游離N-寡糖水平，首先應用PNGase F酶切獲得游離N-寡糖，標記2AB，

11、應用熒光和質譜對N-糖譜分別進行定量和定性分析;其次應用Ides酶將蛋白分為兩部分，應用游離N-寡糖相同的檢測手段，對兩部分的N-寡糖水平分別進行表征;在O-糖修飾水平，應用糖苷酶(PNGase F)、唾液酸酶(Neuraminidase)和胰酶(Trypsin)處理樣品，獲得保留O-糖核心糖單元修飾的肽段，應用LC-MS/MS對O-糖基化進行定位研究。
　　糖基化與穩(wěn)定性和功能關系部分:我們應用了多種糖苷酶(PNGase F、E

12、ndoF2、Neuraminidase和O-Glycosidase)對樣品進行處理，并從酶切系統(tǒng)中分離純化出了處理后的CTLA4-Ig融合蛋白，以進行后續(xù)實驗研究。在穩(wěn)定性方面:第一，通過SEC測定不同酶切時間處理前后樣品純度的變化;第二，應用0.22um的濾膜除菌后，進行45℃下的加速實驗，在0、1、3、5、7、9、11和12周取樣，通過SEC測定樣品純度的變化;第三，應用DSF測定不同時間酶切處理后，樣品整體熱力學參數(shù)的變化;第四，

13、應用DSC測定不同時間酶切處理，樣品各結構域熱力學參數(shù)變化。在功能方面:對于Fc段結合活性，我們選擇報告基因法測定了酶切樣品與Fc受體的結合活性變化，也間接體現(xiàn)了CTLA4-Ig蛋白的ADCC活性變化;對于CTLA4段結合活性，我們應用ForteBio技術，分別測定酶切前后樣品與B7-1和B7-2的親和力;對于細胞生物學活性，我們選擇報告基因法測定酶切樣品，阻斷Duadi細胞結合并激活Jurkat細胞的能力，以評估其生物學活性。

14、　　本研究證明，通過CHO表達系統(tǒng)培養(yǎng)獲得的CTLA4-Ig蛋白，含有非常復雜的糖基化修飾:其中6個N糖基化修飾，位于CTLA4段的4個N糖基化修飾相對比較復雜，含有大量的末端唾液酸修飾，而位于Fc段的兩個N糖基化修飾相對比較簡單，與經典的單克隆抗體的糖基化修飾相似;研究結果明確了O糖基化修飾的個數(shù)和位置，分別為鉸鏈區(qū)肽段上的第2、8、11和20位的絲氨酸，存在O糖基化修飾;并通過質譜強度，初步確定了含不同O糖基化修飾個數(shù)的比例。通過不