ISG15的原核表達和多克隆抗體的制備及其與豬瘟病毒相互作用的初步研究.pdf

1、豬瘟病毒是豬烈性傳染病豬瘟的病原，屬于黃病毒科瘟病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒，能夠在感染的豬體內引起持續(xù)性感染。ISG15是一種由Ⅰ型干擾素誘導機體產(chǎn)生的抗病毒蛋白，研究表明ISG15對一些病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1)、B型流感病毒等具有抗病毒作用。本實驗室使用基因芯片技術檢測豬瘟病毒感染豬只的外周血單個核細胞的基因轉錄譜的研究中，發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染豬后1、3、6、9天采集的外周血淋巴細胞中ISG15基因mRNA分別呈2.63

2、、4.51、4.43、2.18倍的變化。本研究的目的是為了進一步在蛋白水平上驗證感染豬瘟病毒后細胞ISG15的表達變化，并探討在宿主細胞中ISG15與豬瘟病毒之間的相互關系，為進一步探索豬瘟病毒的持續(xù)性感染的分子機制打下基礎。
　　 本研究通過重組人I型干擾素IFNα-2b誘導PK-15細胞轉錄干擾素刺激基因，RT-PCR方法擴增ISG15基因，并克隆至pMD18-T載體上，再將ISG15基因亞克隆至原核表達載體pGEX-4T-

3、1與真核表達載體pCDNA3.0。重組原核表達載體pGEX-ISG15轉化BL21菌株，IPTG誘導表達ISG15重組蛋白，經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化重組蛋白，將純化的ISG15重組蛋白與弗氏佐劑乳化免疫小鼠，制備ISG15多克隆抗體。重組真核表達載體pCDNA-ISG15用脂質體介導的方法轉染PK-15細胞，用新霉素類抗生素G418篩選獲得穩(wěn)定表達ISG15蛋白的PK-15細胞系。
　　 通過制備的ISG15多克隆抗體，用間接免