高原低氧環(huán)境對骨髓造血干細胞增殖與定向選擇分化的影響及其機制研究.pdf

1、目的：長期高原低氧環(huán)境生活會代償性的引起機體紅細胞生成增多。過度的紅細胞生成會導(dǎo)致血液粘度增高，微循環(huán)阻力增加，加重組織細胞缺氧，并可引起一系列臨床癥狀。既往研究雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了低氧刺激機體生成高水平的促紅細胞生成素(EPO)是高原紅細胞增多的重要發(fā)生機制，但通過對高原生活人群的觀察發(fā)現(xiàn)EPO的水平與紅細胞的增生程度常常并不相關(guān)，提示存在非EPO途徑和機制。
　　 在成年機體，包括紅細胞在內(nèi)的所有類型成熟血細胞均起源于造血干細胞。

2、研究發(fā)現(xiàn)造血干細胞參與了失血、感染等應(yīng)激情況下的紅細胞、白細胞生成過程，因此我們推測造血干細胞可能對高原低氧環(huán)境發(fā)生反應(yīng)并在高原紅細胞增生的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本課題針對這一問題展開研究。
　　 方法：以模擬海拔6000m低氧環(huán)境暴露小鼠為模型，觀察高原低氧環(huán)境暴露0，1，3，7，14，28天對骨髓與脾臟Lineage-Sea-1+c-Kit+(LSK)表型造血干細胞的數(shù)量、增殖狀況與定向分化系選擇性的影響。在此基礎(chǔ)上，將正常小

3、鼠的骨髓LSK細胞置于不同的EPO濃度、不同的氧濃度下進行培養(yǎng)，或在培養(yǎng)體系中分別加入常氧和低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清，觀察培養(yǎng)后Sca-1+造血干細胞的增殖情況與定向分化潛能，以探討機體高原低氧暴露時調(diào)控造血干細胞反應(yīng)的可能機制。
　　 結(jié)果：暴露于模擬海拔6000m低氧環(huán)境的小鼠骨髓和脾臟中l(wèi)ineage-Sca-1+c-Kit+(LSK)表型造血干細胞數(shù)量均顯著擴增，增加的造血干細胞既包括通常處于活躍細胞周期的短期重建造血

4、能力造血干細胞(CD34+LSK細胞)，也包括通常維持靜息狀態(tài)的長期重建造血能力造血干細胞(CD34-LSK細胞)，低氧暴露時，骨髓和脾臟CD34+LSK細胞與CD34-LSK細胞的增殖率(BrdU摻入率)均顯著增高，但細胞凋亡率無改變。
　　 在小鼠低氧暴露的28天時間范圍內(nèi)，骨髓LSK造血干細胞在第3-28天呈現(xiàn)持續(xù)性的增殖，而脾臟造血干細胞只在第3-14天呈現(xiàn)暫時性的增殖，到第28天回落到低氧暴露前水平，即骨髓造血干細胞的

5、變化時相性更符合高原紅細胞長期慢性增多過程特點。另外，小鼠全身骨髓造血干細胞總數(shù)量約為脾臟造血干細胞的10倍，因此骨髓造血干細胞的增殖對高原紅細胞增多可能發(fā)揮更大的作用。
　　 通過對骨髓早期定向祖細胞的分析發(fā)現(xiàn)，在巨核-紅系祖細胞(MEP)數(shù)量隨著機體低氧暴露時間延長不斷增多的同時，粒-單核祖細胞(GMP)數(shù)量在低氧暴露7-14天時出現(xiàn)暫時性的下降，通過觀察排除了增殖和凋亡情況改變導(dǎo)致GMP減少的可能性，提示上游造血干細胞定向

6、分化系選擇性的變化導(dǎo)致了GMP的減少。對骨髓LSK造血干細胞紅系和粒-單系定向分化潛能的直接觀察結(jié)果證實了上述推測。一是低氧暴露小鼠骨髓LSK細胞紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達量增高，對應(yīng)粒-單系特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達量降低；二是低氧暴露小鼠的骨髓LSK細胞在體外半固體培養(yǎng)基上能形成較多比例的BFU-E紅系集落和較少比例的CFU-GM粒巨噬系集落；三是低氧暴露小鼠的骨髓LSK細胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后能形成更多的Ter119+

7、紅系前體細胞。
　　 通過將正常小鼠的骨髓LSK細胞在不同的EPO濃度、不同的O2濃度、或分別在培養(yǎng)體系中加入常氧與低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清進行培養(yǎng)得到以下結(jié)果：
　　 第一、EPO水平的升高不影響培養(yǎng)后Sca-1+造血干細胞的增殖與紅系定向分化潛能。
　　 第二、現(xiàn)有研究認為正常生理條件時骨髓多數(shù)造血干細胞的居留環(huán)境氧分壓約相當(dāng)于5％O2濃度，此氧分壓可能隨外界低氧環(huán)境進一步降低，但未觀察到比5％O2更低的氧

8、分壓(2％O2)能促進培養(yǎng)后Sca-1+造血干細胞的增殖和紅系定向分化潛能。
　　 第三、將低氧暴露小鼠的骨髓培養(yǎng)上清加入LSK細胞培養(yǎng)體系可以顯著促進培養(yǎng)后Sca-1+造血干細胞的增殖和紅系定向分化潛能，通過抗體中和實驗證明了低氧暴露后骨髓微環(huán)境中分泌增多的白介素3和白介素6參與了對造血干細胞的擴增作用，白介素3還參與了促進造血干細胞紅系定向分化潛能。
　　 結(jié)論：高原低氧環(huán)境下，一方面，骨髓造血干細胞通過增殖從數(shù)量上