死亡相關(guān)蛋白(DAP5)對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：順鉑(cisplatin,DDP)是當(dāng)前腫瘤聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。由于可造成急性腎小管損傷而限制了其臨床應(yīng)用,其中腎小管上皮細胞凋亡是順鉑引起急性腎小管細胞損傷的主要機制之一。死亡相關(guān)蛋白(DeathAssociated Protein,DAP5)作為調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的重要因子,在應(yīng)激或凋亡等經(jīng)典蛋白質(zhì)翻譯途徑被抑制的情況下,DAP5可通過內(nèi)部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site,IRES)

2、途徑來促進某些蛋白質(zhì)翻譯表達,以維持細胞的正常生存。但是DAP5在順鉑引起急性腎小管損傷過程中具體機制還不清楚。本研究在體內(nèi)和體外建立順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡模型的基礎(chǔ)上,觀察DAP5在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡過程中的表達變化,研究DAP5對細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響,探討DAP5在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的具體調(diào)控機針。進而研究DAP5是否受調(diào)控蛋白翻譯的重要信號通路(PBK/Akt/mToR)的影響,為臨床防護順鉑引起

3、的急性腎損傷提供新的方法。
　　 方法：⑴順鉑誘導(dǎo)急性腎小管上皮細胞凋亡體內(nèi)與體外模型的建立:對青年Wistar大鼠腹腔注射順鉑72h后,建立體內(nèi)腎小管細胞凋亡模型,利用腎功能指標和腎組織病理評分對腎臟損傷程度進行評估,TUNEL染色檢測細胞凋亡,western blot方法檢測caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)指標的變化情況；應(yīng)用不同濃度梯度的順鉑對人腎小管上皮細胞(HK(

4、C)刺激24h后建立體外模型,應(yīng)用細胞核Hocbtest染色及流式細胞儀對凋亡細胞進行檢測,western blot方法驗證上述凋亡相關(guān)指標的蛋白質(zhì)表達變化。⑵DAP5調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的HKC細胞凋亡的作用。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術(shù)過表達及下調(diào)HKC細胞內(nèi)的DAP5表達,在此基礎(chǔ)上觀察對順鉑誘導(dǎo)這兩種HKC細胞凋亡的影響,應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡程度,western blot檢測細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白水平的表達,探討DAP5

5、在順鉑誘導(dǎo)HKC細胞凋亡中的具體作用機制。檢測順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡過程中PI3K/Akt/mTOR信號通路的變化,并應(yīng)用triciribine(Akt特異性抑制荊)和rapamycin(mToR特異性抑制劑)阻斷該信號通路后,用western blot檢測對DAP5表達變化的影響,探討PI3K/Akt/mTOR通路與DAP5的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果：大鼠經(jīng)腹腔注射順鉑72h后,發(fā)生急性腎損傷,血肌酐及尿素氮明顯增高。病理組

6、織學(xué)顯示近端腎小管上皮細胞損傷,出現(xiàn)空泡樣變性和顆粒樣變性,近端腎小管擴張,腎小管腔中可見蛋白質(zhì)管型。小管刷狀緣脫落,細胞排列紊亂。腎小管上皮細胞經(jīng)TUNEL染色后陽性率明顯增加。應(yīng)用western blot對caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)指標進行檢測,發(fā)現(xiàn)caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表達水平在模型組中較對照組明顯增高,Bcl-2則較對照組

7、明顯下降。在體外應(yīng)用不同濃度的順鉑(1～100μM)作用于HKC細胞24h后,采用Hochest染色和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡隨順鉑濃度的增加而增加。對體外實驗的凋亡相關(guān)指標進行檢測,結(jié)果與體內(nèi)實驗的變化一致,caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bax蛋白表達水平隨順鉑濃度的增高而增加,而Bcl-2則隨之下降。同時,在順鉑誘導(dǎo)的HKC細胞凋亡過程中,可見DAP5裂解生成86KDa片段的蛋白質(zhì)-DAP5/p86。

8、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后過表達DAP5/p97和DAP5/p86后均可使Bcl-2的表達增加,并可減輕順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡；而利用siRNA負向調(diào)控DAP5則可使Bcl-2表達下降,并導(dǎo)致細胞凋亡增加。過表達或負向調(diào)控DAP5均對Bax的表達無影響。進而在順鉑誘導(dǎo)的凋亡過程中對PI3K/AKT/mTOR信號通路進行了檢測,可見PI3K、p-Akt和p-mTOR表達下調(diào),提示該信號通路被抑制,應(yīng)用triciribine和rapamycin阻斷PI3K/

9、Akt/mTOR通路后可見DAP5表達下降,Bcl-2和Bax表達降低。因而發(fā)現(xiàn)DAP5受PI3K/Akt/mTOR通路的正向調(diào)控。
　　 結(jié)論：本實驗成功建立了順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡的體內(nèi)與體外模型,首次對DAP5在順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡中的作用機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細胞凋亡過程中DAP5可裂解為86KDa的蛋白片段DAP5/p86,全長DAP5/p97與裂解后DAP5/p86均可促進抗凋亡基因Bcl-2的翻