NALP3-siRNA對缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：觀察缺氧/復(fù)氧對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)的損傷以及對胞內(nèi)模式識別受體NALP3蛋白表達(dá)的影響。并通過構(gòu)建NALP3-siRNA抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞NALP3的表達(dá)，探討其對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法：(1)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力條件形成缺氧條件，缺氧1h，分別復(fù)氧1h、2h、4h、8h、16、24h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。胎盤藍(lán)攝取法進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，并檢測培養(yǎng)上清液中的乳酸

2、脫氫酶(LDH)含量以及細(xì)胞NALP3蛋白的表達(dá)。(2)根據(jù)大鼠NALP3全長基因序列設(shè)計并合成NALP3-si-RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)，以無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組作為對照。用Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞NALP3蛋白的表達(dá)。(3)將細(xì)胞分為正常對照組、H/R組、無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組和NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組。利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力形成缺氧條件，缺氧1h復(fù)氧4h后檢測培養(yǎng)液上清LDH的含量和細(xì)胞NA

3、LP3蛋白的表達(dá)。(4)采用AnnexinV/IP染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；Western印跡法檢測細(xì)胞IκB-α、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)；EMSA檢測NF-κBDNA結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：(1)與對照組相比，NRK-52E缺氧/復(fù)氧后LDH升高(p＜0.05)，活細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞存活率較對照組顯著下降(p＜0.05)，細(xì)胞NALP3表達(dá)逐漸增加，在復(fù)氧4h達(dá)到高峰。(2)特異性NALP3-siRNA能有效抑制NR

4、K-52E的NALP3表達(dá)，與無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組相比，NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組NALP3蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(p＜0.05)。(3)經(jīng)缺氧復(fù)氧后，NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量和NALP3蛋白表達(dá)表達(dá)顯著增加。與無關(guān)siRNA相比，LDH含量和NALP3的表達(dá)有顯著下降(P＜0.05)。(4)與對照組相比，H/R后細(xì)胞IκB-α磷酸化和降解以及NF-κBDNA結(jié)合活性增加，細(xì)胞NALP3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)明顯

5、上調(diào)，而NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞IκB-α蛋白的降解，NF-κBDNA結(jié)合活性以及Bax/Bcl-2蛋白的比值均低于無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05）。同時，與對照組相比各組細(xì)胞凋亡率明顯增多，其中NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05）。
　　 結(jié)論：H/R使腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NALP3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。NALP3-si-RNA能夠顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NALP3的表達(dá)，