肥胖患者及非酒精性脂肪性肝病患者基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，人民生活水平快速提高、飲食習(xí)慣發(fā)生了很大的改變，長(zhǎng)期的能量攝入與消耗不平衡，使人體內(nèi)的脂肪組織大量增加，即被定義為肥胖。在超過三十年的時(shí)間里，肥胖成為全球性的健康問題。在已知研究中，發(fā)現(xiàn)肥胖與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中以肝臟疾病、Ⅱ型糖尿病、心腦血管疾病及某些特定癌癥為代表。而飲酒人數(shù)劇增以及受到的藥物影響等因素，加上預(yù)防醫(yī)療措施相對(duì)滯后，被稱為現(xiàn)代“富貴病”的脂肪性肝病發(fā)病率在我國(guó)呈逐年增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前脂肪性

2、肝病發(fā)病率較5年前增加了50倍，而且有年齡向低齡化發(fā)生的趨勢(shì)。尤其是一些經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)，脂肪性肝病已成為一種常見疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示:脂肪性肝病的發(fā)病率已占到平均人口的10％，在肥胖、嗜酒和糖尿病人群中可高達(dá)50％～60％，不少醫(yī)院甚至查出十四五歲的小脂肪性肝病患者。脂肪性肝病按照病因一般分為兩大類，酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病除了與酒精性脂肪性肝病一樣可導(dǎo)致肝病相關(guān)殘疾和死亡外，還與Ⅱ型糖尿病、代謝

3、綜合征及其相關(guān)心腦血管病事件有著密切的關(guān)系。因此，脂肪性肝病已成為當(dāng)代肝病領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)，對(duì)人類健康和社會(huì)造成了巨大的威脅。大量研究已經(jīng)證實(shí)，非酒精性脂肪性肝病與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、高血脂代謝綜合征等機(jī)體代謝紊亂的疾病以及心血管疾病密切相關(guān)，若這些疾病沒有得到有效的控制或治療，將會(huì)伴隨NAFLD的發(fā)生，且疾病之間相互作用滲透，形成惡性的循環(huán)。
　　80年代未隨著人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)，隨著現(xiàn)代生物學(xué)與醫(yī)學(xué)科學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、信息科

4、學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科相互滲透并高度交叉形成的一門新興前沿學(xué)科——生物信息學(xué)。隨著基因組測(cè)序數(shù)據(jù)迅猛增加，特別是人類基因組計(jì)劃的順利推進(jìn)，產(chǎn)生了海量的生物學(xué)數(shù)據(jù)，生物分子數(shù)據(jù)的積累速度呈指數(shù)增加。這些數(shù)據(jù)隱藏著豐富的生物學(xué)知識(shí)，具有豐富的內(nèi)涵。充分利用這些數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)處理、分析，揭示這些數(shù)據(jù)的內(nèi)在含義，得到對(duì)人類有用的信息，是生物學(xué)家和數(shù)學(xué)家所面臨的嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。生物信息學(xué)正是為迎接這種挑戰(zhàn)而發(fā)展起來的一個(gè)交叉學(xué)科。
　　本研

5、究利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)公開發(fā)表的肥胖患者數(shù)據(jù)集GDS3602和非酒精性脂肪性肝病數(shù)據(jù)集GSE49541的早期階段(mild)和晚期階段(advanced)的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，利用Qlucore Omics Explorer、BRB-ArrayTools、PANTHER及DAVID進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究利用Qlucore Omics Explorer及DAVID在線分析工具對(duì)數(shù)據(jù)集GDS3602進(jìn)行分析，并結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用

6、網(wǎng)絡(luò)分析肥胖的發(fā)生機(jī)制。同時(shí)用BRB-ArrayTools軟件及DAVID在線分析工具等對(duì)肝纖維化程度不同的mild和advanced非酒精性脂肪性肝病患者進(jìn)行比較，篩選他們之間的差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示，兩個(gè)階段基因表達(dá)差異明顯，說明在出現(xiàn)非酒精性肝硬化前，重度的肝纖維化患者基因表達(dá)已發(fā)生了較大變化，提示非酒精性脂肪性肝病轉(zhuǎn)化為肝硬化這個(gè)過程中，重度肝纖維化是一個(gè)較為重要的階段。我們利用差異基因構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

7、。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)通過與核酸、小分子或者其他蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用來執(zhí)行各種生物功能，蛋白質(zhì)間的相互作用存在于每個(gè)細(xì)胞的生命過程中，是生命活動(dòng)過程的基礎(chǔ)。因此，繪制蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜，將會(huì)幫助我們了解許多生命活動(dòng)的機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的影響可以用不同的參數(shù)來描述，通過對(duì)于網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算，選取合適的條件，我們可以得到對(duì)于蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)較為重要的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)的存在對(duì)于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性至關(guān)重要，所以這些核心節(jié)點(diǎn)在疾病的發(fā)展過

8、程中處于重要位置，對(duì)于這些節(jié)點(diǎn)可以作為潛在的治療靶點(diǎn)，經(jīng)過對(duì)獲得的上調(diào)蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)和下調(diào)蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的分析計(jì)算，分別獲得了10個(gè)核心節(jié)點(diǎn)，和17個(gè)核心節(jié)點(diǎn)。我們將這些核心節(jié)點(diǎn)分別與上調(diào)表達(dá)差異基因和下調(diào)表達(dá)差異基因進(jìn)行映射，于是共獲得了12個(gè)重合的基因，CYP3A4、EFHD1、GALK1、GCDH、GSTZ1、MT1X、SORL1、CACNA2D1、EPHA3、GINS1、GINS2和GJA這12個(gè)核心節(jié)點(diǎn)的表達(dá)量發(fā)生了變化，說明

9、這12個(gè)基因?qū)τ诜蔷凭灾拘愿尾〉陌l(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。于是我們?cè)谑占呐R床標(biāo)本中驗(yàn)證它們的表達(dá)量。
　　對(duì)獲得的12個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因原始表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，保留具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。其中EFHD1(P=0.001)、GALK1(P=0.001)、GCDH、(P=0.004)和MT1X(P=0.01)的mRNA表達(dá)量在早期非酒精性脂肪性肝病中顯著升高，CACNA2D1(P=0.002)、EPHA3(P=0.003)、GIN

10、S1(P=0.001)和GJA1(P=0.01)的mRNA表達(dá)量在晚期非酒精性脂肪性肝病中顯著升高，構(gòu)建ROC(receiveroperating characteristic)曲線用以預(yù)測(cè)早晚期非酒精性脂肪性肝病核心蛋白mRNA表達(dá)水平。qPCR結(jié)果表明8核心節(jié)點(diǎn)基因的在早晚期非酒精性脂肪性肝病中表達(dá)顯著不同，特別是EFHD1、GALK1、GCDH、CACNA2D1、 MT1X、EPHA3、GINS1、GJA1，可能在非酒精性脂肪肝進(jìn)

11、展的生物過程扮演了一個(gè)重要的角色。ROC曲線分析還表明，這些核心節(jié)點(diǎn)基因可以區(qū)分非酒精性脂肪肝早晚期患者，雖然診斷準(zhǔn)確度不是很高(AUC=0.621-0.719)。
　　在這些核心節(jié)點(diǎn)基因中，CACNA2D1，EPHA3，GINS1及GJA1在晚期NAFLD中表達(dá)上調(diào)，提示這些基因在晚期NAFLD中發(fā)揮著重要的作用。CACNA2D1編碼的蛋白屬于α-2蛋白亞族，α-2蛋白屬于電壓依賴型鈣離子通道復(fù)合體，CACNA2D1被報(bào)道同癲癇

12、、智力缺陷、肥胖及胰島功能亢進(jìn)等臨床癥狀相關(guān)，而這些影響同時(shí)很有可能由GALK1的突變導(dǎo)致。EPHA3屬于酪氨酸激酶的肝配蛋白受體亞族。該基因的缺失被認(rèn)為是潛在的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）的保護(hù)因素。EphA3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，該蛋白的合成被認(rèn)為同多種腫瘤相關(guān)。GINS1在DNA復(fù)制中發(fā)揮重要作用。GJA1基因突變主要是常染色體顯性遺傳疾病。對(duì)這些核心蛋白編碼

13、基因在非酒精性脂肪肝和健康樣本的表達(dá)水平進(jìn)行分析，我們進(jìn)一步計(jì)算晚期以及早期非酒精性脂肪性肝病與正常人群的差異表達(dá)基因。通過ROC曲線分析，我們進(jìn)一步的分析了早期NAFLD蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)中的6個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因（EFHD1、GALK1、GCDH、SORL1、EPHA3和GINS2）的表達(dá)量。其中的4個(gè)基因（EFHD1、GALK1、GCDH和SORL1）具有符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的AUC值，可以被用來提高早、晚期NAFLD患者診斷準(zhǔn)確率。
　　

14、這些分析表明，EFHD1、GALK1、GCDH、MT1X、CACNA2D1、EPHA3、GINS1和GJA1是診斷早晚期非酒精性脂肪性肝病的潛在生物標(biāo)記物。這些基因往往出現(xiàn)跨多個(gè)腫瘤相關(guān)疾病，如直腸癌、肺癌、前列腺癌、胃癌，以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝癌，這表明他們可能在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，并可能在未來發(fā)展成為有效的診斷方法。
　　而在對(duì)肥胖患者同NAFLD患者基因表達(dá)譜的共同分析中發(fā)現(xiàn)，GCDH在肥胖患者