JNK-AQP5在高滲誘導的人角膜上皮細胞干眼模型中的作用.pdf

1、目的：
　　探討AQP5的表達和.JNK的磷酸化在高滲誘導的人角膜上皮細胞干眼模型中的作用，為干眼病的抗炎治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先檢測不同程度高滲透壓(450 mOsm、500 mOsm、550 mOsm)刺激后用real-time PCR檢測HCECs中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和凋亡因子caspase-1，及AQP5的mRNA的相對表達量的變化趨勢，Western-blot檢

2、測AQP5和p-JNK的蛋白水平表達變化趨勢，并選擇出最佳的高滲透壓進行后續(xù)實驗。通過加入20μM JNK抑制劑SP600125預處理2h的HCECs后，再給予500 mOsm高滲透壓刺激，同時設310 mOsm等滲組（Control組）和500 mOsm高滲+二甲基亞楓(DMSO)為對照組，用real-time PCR檢測IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、caspase-1和AQP5的mRNA基因表達變化，Western-b

3、lot檢測JNK磷酸化水平和AQP5的蛋白表達變化，免疫熒光檢測AQP5的蛋白表達變化及TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況變化。并通過設計合成靶向人AQP5的干擾RNA，并將其轉染至HCECs，再給予500 mOsm高滲透壓刺激，同時設310 mOsm等滲組（Control組）和500 mOsm高滲+陰性轉染(siNC)為對照組，用同樣的方法檢測上述炎癥因子、凋亡水平及AQP5的表達變化。
　　結果：
　　1.不同程度高滲透壓

4、的選擇
　　Real-time PCR檢測結果顯示:相對于310 mOsm等滲對照組，450 mOsm高滲濃度組的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和凋亡因子caspase-l，及AQP5的mRNA相對表達量升高均不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);500 mOsm和550 mOsm高滲濃度組的上述因子的mRNA相對表達量均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，且以500 mOsm最為顯著。同時，W

5、estern-blot檢測結果顯示:與310 mOsm等滲對照組相比，500 mOsm高滲透壓組的HCECs中AQP5(p=0.001)和p-JNK(p=0.003)的蛋白表達水平也有顯著性的升高，差異具有統(tǒng)計學意義。所以，我們選擇500 mOsm為本細胞株是較佳的實驗刺激滲透壓。
　　2.加入JNK抑制劑SP600125預處理后，高滲刺激下人角膜上皮細胞炎癥因子表達、p-JNK和AQP5表達及凋亡情況變化
　　Real-t

6、ime PCR檢測結果顯示:給予20μM JNK抑制劑SP600125預處理2h的HCECs中JNK的磷酸化水平被抑制，對500 mOsm高滲刺激反應明顯減弱，相對于Control組，500 mOsm高滲組炎癥因子IL-1β(p=0.003)、IL-6(p＜0.001)、IL-8(p=0.011)、TNF-α(p=0.007)和凋亡因子caspase-1(p=0.009)的mRNA的相對表達量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500

7、 mOsm高滲+二甲基亞砜(DMSO)組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組炎癥因子IL-1β(p=0.006)、IL-6(p=0.007)、IL-8(p=0.011)、TNF-α(p=0.009)和凋亡因子caspase-1(p=0.012)的mRNA的相對表達量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義。Western-blot法檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組AQP5的蛋白表達量(p＜0.001)和JNK的磷酸化

8、水平(p=0.012)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組AQP5的蛋白表達量(p=0.008)和JNK的磷酸化水平(p=0.001)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。免疫熒光法檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組AQP5的蛋白表達量明顯升高;相對于500 mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組AQP5的蛋白表達量明顯降低

9、。TUNEL法檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組(p＜0.001) TUNEL法染色陽性細胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500 mOsm高滲+DMSO組，500 mOsm高滲+JNK抑制劑組(p=0.015)染色陽性細胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.高滲刺激下轉染siAQP5的人角膜上皮細胞炎癥因子表達和凋亡情況變化
　　成功轉染siAQP5干擾RNA后的HCECs中AQP5基

10、因和蛋白表達均被明顯抑制，對500 mOsm高滲刺激無明顯反應。Real-time PCR檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組(p=0.007) AQP5的mRNA相對表達量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500 mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉染組(p=0.010) AQP5的mRNA相對表達量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義。Western-blot法檢測結果顯示:相對于Cont

11、rol組，500 mOsm高滲組(p=0.002) AQP5的蛋白表達量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉染組(p=0.016) AQP5的蛋白表達量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義。Real-time PCR檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組炎癥因子IL-1β(p＜0.001)、IL-6(p=0.004)、IL-8(p=0.001)、TNF-α

12、(p＜0.001)和凋亡因子caspase-1(p=0.004)的mRNA的相對表達量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500 mOsm高滲+陰性轉染(siNC)組，500 mOsm高滲+siAQP5轉染組炎癥因子IL-1β(p＜0.001)、IL-6(p=0.005)、IL-8(p=0.002)、TNF-α(p＜0.001)和凋亡因子caspase-1(p=0.005)的mRNA的相對表達量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義。TUNE

13、L法檢測結果顯示:相對于Control組，500 mOsm高滲組(p＜0.001) TUNEL法染色陽性細胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義;相對于500 mOsm高滲+siNC組，500 mOsm高滲+siAQP5轉染組(p＜0.001)染色陽性細胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.高滲刺激下的人角膜上皮細胞干眼模型，JNK的磷酸化和AQP5的表達均明顯升高，同時細胞內(nèi)炎癥因子和凋亡因子也升高，促進細胞的