別藻藍蛋白的生物合成及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、別藻藍蛋白是藻膽蛋白中的一種，主要存在于藍藻和紅藻中，是一種輔助色素蛋白，在生物體中主要擔任能量傳遞與部分能量貯存的功能，具有熒光特性。別藻藍蛋白具有廣闊的應用前景，它除了可用于食品、化妝品等領域外，還可將其制成熒光試劑，在生物醫(yī)學等領域得以應用。
　　目前別藻藍蛋白獲取的主要途徑為從藻體中提取。別藻藍蛋白的獲取需經過藻種培育、提取純化等過程，獲取周期長、分離純化困難、制備成本高，這很大程度上限制了它的應用，成為別藻藍蛋白熒光探針

2、試劑化、商業(yè)化的主要限制因素。為了更加快速、簡捷地獲取別藻藍蛋白，分子生物學方法過程簡單、提取純化方便、制備成本低，成為現階段熱門的制備研究方法。但通過生物學基因克隆手段獲得的重組別藻藍蛋白熒光穩(wěn)定性差，在受熱、pH值變化以及長時間放置的情況下容易變性，直接限制了它在熒光試劑方面的應用。
　　本試驗首先對重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件進行優(yōu)化，利用響應面法優(yōu)化別藻藍蛋白在大腸桿菌體內的重組表達條件，最后獲得的最佳發(fā)酵條件為：誘導溫度28℃

3、、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH8.5、誘導時間3 h、IPTG終濃度0.1 mM，利用該條件發(fā)酵得到的重組別藻藍蛋白含量與優(yōu)化前本試驗原始誘導條件誘導的結果(即表達量9 mg/L)相比較，蛋白表達量增加為原來的2.3倍(即表達量20.4 mg/L),與文獻報道的重組別藻藍蛋白α亞基蛋白表達量3-12 mg/L[54]相比較，表達量提高了70％-580%。
　　在發(fā)酵結果高效穩(wěn)定的前提下，對重組別藻藍蛋白的穩(wěn)定性從分子水平和結構水平兩方面入手

4、展開試驗研究分析。在其分子水平分析中，通過比對兩種不同藻種集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)和嗜熱藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)別藻藍蛋白β亞基的氨基酸序列，發(fā)現了14個位點的氨基酸不同（我們將其定義為差異位點），通過定點突變、發(fā)酵表達及熱穩(wěn)定性分析等一系列試驗，最后獲得了11個位點的14個定點突變體（其中包括11個但位點突變體和3個雙位點突變體），并證明這11個位點

5、與別藻藍蛋白熱穩(wěn)定性存在很大關聯，猜測其參與了別藻藍蛋白的結構穩(wěn)定性調控。
　　在其結構水平分析中，通過追蹤重組別藻藍蛋白合成的整個生物反應過程，對過程中與重組別藻藍蛋白穩(wěn)定性相關的因素進行試驗分析。試驗比較了不同裂合酶的催化效果，發(fā)現不同裂合酶對色基與脫輔基蛋白的催化結合作用存在明顯差異；同時通過基因工程手段表達獲得色基、裂合酶和脫輔基蛋白的單一物質，實現了重組別藻藍蛋白色基與脫輔基蛋白的體外催化合成及重組別藻藍蛋白三聚體的體外

6、自組裝，摸索了重組別藻藍蛋白的體外催化合成及自組裝試驗條件，通過體外催化合成試驗獲得的重組別藻藍蛋白(APC-α, APC-β)色基結合率分別由原來的28.6%和14.3%提高至90%左右，分別為原色基結合率的3倍和6倍，色基結合率提高效果顯著；試驗分別通過藻體提取、直接表達獲取以及表達后進一步體外催化組裝方法獲得三種色基結合率不同的別藻藍蛋白三聚體（即色基結合率：天然APC＞組裝APC＞表達APC），對三種別藻藍蛋白三聚體進行溫度及p