不同作物光合特性比較及籽粒莧C4途徑關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá).pdf

1、C4植物有“CO2泵”濃縮機(jī)制，在高溫，強(qiáng)光，干旱等逆境條件下，具有高的光合效率和生物學(xué)產(chǎn)量。通過(guò)基因工程技術(shù)，將C4途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入C3作物，有利于提高C3植物光合效率，增強(qiáng)對(duì)高溫、干旱等惡劣環(huán)境的適應(yīng)，提高產(chǎn)量。本研究通過(guò)比較了C4與C3作物，雙子葉與單子葉植物的光合特性，通過(guò)Southern blot明確了C4途徑關(guān)鍵酶PEPC基因在雙子葉C4植物籽粒莧基因組中的拷貝數(shù)，構(gòu)建了籽粒莧PEPC基因和另一個(gè)C4途徑關(guān)鍵酶NAD-ME

2、基因的原核表達(dá)載體，并且這2個(gè)基因在Transetta(DE3)菌株中高效表達(dá)。
　　 (1)利用CB-1102便攜式光合蒸騰儀對(duì)籽粒莧、玉米和煙草的光合特性進(jìn)行測(cè)定，Excel2007及SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明:C4植物籽粒莧和玉米凈光合速率(Pn)高于C3單子葉植物煙草;三種作物凈光合速率對(duì)光照的響應(yīng)為正相關(guān)，Pn隨光照的增強(qiáng)而增大;籽粒莧及玉米Pn與溫度的關(guān)系在20-40℃范圍內(nèi)呈正相關(guān)，煙草Pn與溫度在1

3、5-30℃范圍內(nèi)呈正相關(guān)，35-40℃范圍內(nèi)Pn隨溫度的升高而降低。
　　 (2)通過(guò)CTAB法提取籽粒莧基因組DNA，凝膠電泳和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行定量和定性分析。利用多種限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，純化回收，0.7％凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、固定及免疫檢測(cè)。利用DIG標(biāo)記的PEPC基因作為探針進(jìn)行Southern雜交，初步確定籽粒莧基因組中PEPC基因的拷貝數(shù)為3個(gè)。
　　 (3)以質(zhì)粒pUC18T-PEPC為模板，PCR

4、擴(kuò)增得到PEPC基因的全長(zhǎng)cDNA，長(zhǎng)度為2895bp（GenBank登錄號(hào)為HQ186302），編碼964個(gè)氨基酸。以pSURE-aME-cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到ME基因cDNA全長(zhǎng)，長(zhǎng)度為1872bp（GenBank登錄號(hào)為HQ186303），編碼623個(gè)氨基酸。通過(guò)基因重組構(gòu)建pEASY-E1-(NAD)-ME和pEASY-E1-PEPC原核表達(dá)載體，經(jīng)PCR、酶切鑒定及測(cè)序，表明目的基因PEPC和ME成功插入原核表達(dá)載體p