?；撬徂卓鼓懠t素聽覺中樞毒性機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分明確SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核GABAergic效應(yīng)逆轉(zhuǎn)時(shí)間
　　目的:聽覺障礙是新生兒膽紅素腦病的臨床表現(xiàn)之一，但是具體機(jī)制不明。興奮毒性是膽紅素腦病導(dǎo)致新生兒聽覺損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究顯示，GABA受體是中樞最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體，大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元在發(fā)育過程中都會(huì)經(jīng)歷GABA能（GABAergic）效應(yīng)由去極化向超極化的轉(zhuǎn)變。膽紅素會(huì)顯著增加未成熟聽覺核團(tuán)的GABAergic突觸傳遞。我們猜測(cè)，膽紅素可能通過

2、增加去極化的GABAergic效應(yīng)對(duì)未成熟神經(jīng)元產(chǎn)生興奮毒性。但是，腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元GABAergic效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)時(shí)間目前仍然不明。本研究旨在明確SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元GABAergic效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)時(shí)間及該核團(tuán)內(nèi)不同類型神經(jīng)元GABAergic效應(yīng)逆轉(zhuǎn)的時(shí)間之間是否有差異，該項(xiàng)研究對(duì)于了解膽紅素興奮毒性對(duì)腹前側(cè)耳蝸核不同類型神經(jīng)元的作用時(shí)間及方式具有重要意義。
　　方法:急性單離出生后5到15天(postnatalday5-15

3、，P5-15)的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核，將神經(jīng)元分為P5-7、P9-11、P13-15三組。聯(lián)合形態(tài)學(xué)和膜片鉗電生理的方法區(qū)分SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核的bushy細(xì)胞和stellate細(xì)胞。在穿孔膜片鉗的電流鉗模式下，給予細(xì)胞膜0pA的電流刺激，記錄每個(gè)神經(jīng)元的靜息電位。在穿孔膜片鉗的電壓鉗模式下，將細(xì)胞膜電位分別鉗制在-80mV、-60mV、-40mV、-20mV、0mV，記錄GABA(100μM)誘發(fā)電流，根據(jù)GABA誘發(fā)電流的幅度和與其

4、對(duì)應(yīng)的鉗制電壓大小，繪制電流-電壓曲線，再利用Nemst公式計(jì)算GABA平衡電位，由GABA平衡電位和靜息電位之間的差值判斷此時(shí)GABAergic效應(yīng)是去極化還是超極化，如果GABA平衡電位小于細(xì)胞靜息電位，此時(shí)GABAergic效應(yīng)引起細(xì)胞產(chǎn)生去極化，細(xì)胞的興奮性增加;如果GABA平衡電位大于細(xì)胞靜息電位，此時(shí)GABAergic效應(yīng)引起細(xì)胞產(chǎn)生超極化，細(xì)胞的興奮性降低。然后明確不同類型神經(jīng)元（bushy細(xì)胞、stellate細(xì)胞）GA

5、BAergic效應(yīng)逆轉(zhuǎn)的具體時(shí)間有無差異及其產(chǎn)生機(jī)制。
　　結(jié)果:在bushy細(xì)胞中，GABAergic效應(yīng)由興奮性逆轉(zhuǎn)為抑制性的百分比分別為:67％（P5-7組）、97％（P9-11組）和100％（P13-15組）。在stellate細(xì)胞中，GABAergic效應(yīng)由興奮性逆轉(zhuǎn)為抑制性的百分比分別為:21％（P5-7組）、35％（P9-11組）和91％（P13-15組）。比較bushy細(xì)胞和stellate細(xì)胞靜息電位之間的差異，

6、發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞靜息電位均值在P5-7組分別為-54.6±5.6mV和-60.6±3.7mV，在P9-11組為-56.7±3.7mV和-62.3±5.0mV，bushy細(xì)胞靜息電位的數(shù)值均大于stellate細(xì)胞;然而在P13-15組兩種細(xì)胞的靜息電位數(shù)值無差異，分別為-61.7±3.2mV和-63.0±3.3mV。兩種細(xì)胞的GABA平衡電位在P5-7組、P9-11組、P13-15組均無差異（分別為P5-7組:-58.3±8.8mVVS.-

7、54.4±11.2mV、P9-11組:-62.8±5.5mVVS.-61.0±8.1mV、P13-15組:-70.4±7.2VS.-72.0±8.1mV)。根據(jù)GABA平衡電位和靜息電位之間的差值，發(fā)現(xiàn)GABAergic效應(yīng)在絕大部分的bushy細(xì)胞為超極化發(fā)生在P7，而其在絕大部分的stellate細(xì)胞為超極化發(fā)生在P13。
　　結(jié)論:SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核的bushy細(xì)胞和stellate細(xì)胞GABAergic效應(yīng)逆轉(zhuǎn)時(shí)間點(diǎn)不同

8、，GABAergic效應(yīng)在bushy細(xì)胞由去極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌瑯O化的時(shí)間發(fā)生在出生后第一周末，而GABAergic效應(yīng)在stellate細(xì)胞由去極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌瑯O化的時(shí)間發(fā)生在出生后第二周末。不同類型細(xì)胞之間靜息電位在發(fā)育過程中的差異可能是bushy細(xì)胞和stellate細(xì)胞GABAergic效應(yīng)在不同時(shí)間點(diǎn)逆轉(zhuǎn)的原因。更持久的去極化GABAergic效應(yīng)可能導(dǎo)致stellate細(xì)胞比bushy細(xì)胞更容易在發(fā)育過程中受到膽紅素的毒性損害。

9、　　第二部分牛磺酸在SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核激活GABAA-R和glycine-R的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:?；撬嵬ㄟ^激活抑制性GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的作用，不同濃度牛磺酸在不同核團(tuán)激活GABAA-R、glycine-R的類型也不盡相同。由于興奮毒性是膽紅素聽覺中樞神經(jīng)毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們猜想?；撬峥赡芡ㄟ^激活抑制性GABAA-R和/或glycme-R產(chǎn)生抑制效應(yīng)，降低細(xì)胞興奮性，從而拮抗膽紅素興奮毒性。

10、但是，目前仍缺乏?；撬嵩赟D大鼠腹前側(cè)耳蝸核對(duì)以上兩種受體激活作用的相關(guān)研究。該項(xiàng)研究不但為其他關(guān)于?；撬崤c腹前側(cè)耳蝸核表面抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體相互作用的研究提供了電生理依據(jù)，還為將?；撬嶙鳛橐环N有效的治療新生兒膽紅素腦病的藥物提供了理論上的可行性。
　　方法:急性單離出生后13-15天的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元，采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，觀察?；撬崤cSD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元（bushy細(xì)胞、stellate細(xì)胞）GABAA-R

11、、glycine-R的相互作用，以及不同濃度?；撬峒せ钜种菩陨窠?jīng)遞質(zhì)受體的類型是否有差異。將SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的膜電位分別鉗制在-60mV、-40mV、-20mV、0mV、20mV，灌流?；撬?、GABA、glycine，根據(jù)?；撬帷ABA、glycine誘發(fā)電流的幅度和與其對(duì)應(yīng)的鉗制電壓大小，繪制電流-電壓曲線，再利用Nernst公式計(jì)算?；撬崞胶怆娢弧ABA平衡電位和glycme平衡電位，從三種激動(dòng)劑平衡電位的數(shù)值大小接近

12、何種離子平衡電位判斷它們引起何種離子的跨膜流動(dòng)。配制不同濃度?；撬?0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、1mM)、GABA(0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM)和glycine(0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3raM)，在全細(xì)胞膜片鉗的電壓鉗模式下，將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV，根據(jù)?；撬帷ABA、glycme誘發(fā)電流的幅度和與其對(duì)應(yīng)的激動(dòng)劑濃度，繪制濃

13、度-效應(yīng)曲線，計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（concentrationfor50％ofmaximaleffect，EC50），比較三種激動(dòng)劑對(duì)各自激活受體的親和性。觀察興奮性氨基酸受體阻滯劑(NBQX、APV)對(duì)?；撬嵴T發(fā)電流的影響。研究三種激動(dòng)劑誘發(fā)電流的相互作用。誘發(fā)電流通過膜片鉗放大器后，經(jīng)A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)，然后進(jìn)行采樣分析。<修稿日期>=
　　結(jié)果:?；撬?、GABA、glycine的逆轉(zhuǎn)電位分別為-10.9±2.4mV

14、、-11.0±1.6mV、-11.8±1.1mV，均接近氯離子平衡電位-12.9mV，提示三種激動(dòng)劑均能引起氯離子的跨膜流動(dòng)。低濃度（0.1mM）、高濃度（1mM）牛磺酸誘發(fā)的電流，都被bicuculline（10μM，GABAA-R阻滯劑）部分阻斷，聯(lián)合加入strychnine（1μM，glycine-R阻滯劑）之后幾乎完全被阻斷，說明被阻斷的電流其實(shí)是牛磺酸激活GABA-R和glycine-R誘發(fā)的，證實(shí)不同濃度牛磺酸均能激活GAB

15、A-R和glycine-R。?；撬岬腅C50為0.074mM，GABA的EC50為0.008mM，glycine的EC50為0.022mM，牛磺酸的EC50大于GABA/glycine的EC50，說明誘發(fā)同樣幅度的氯離子跨膜流動(dòng)，所需的?；撬釢舛却笥贕ABA/glycine，證實(shí)?；撬崾荊ABAA-R和glycine-R的低親和力激活劑，其對(duì)GABAA-R的激活效應(yīng)低于GABA，對(duì)glycine-R的激活效應(yīng)低于glycine。0.1m

16、M?；撬嵴T發(fā)的電流幅度不受NBQX（AMPA受體阻滯劑）、APV（NMDA受體阻滯劑）影響，證實(shí)?；撬岵患せ钆d奮性谷氨酸的AMPA受體和NMDA受體。同時(shí)灌流GABA和glycine誘發(fā)的電流幅度（actualcurrentsevokedbyacombinationofGABAandglycine，IGABA+Gly）小于單獨(dú)灌流GABA誘發(fā)電流幅度與glycine誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevoked

17、separatelybyGABAandglycine,IEX(GABA+Gly),證實(shí)GABA和glycine誘發(fā)電流之間存在“交叉抑制”;而同時(shí)灌流?；撬岷虶ABA誘發(fā)的電流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurineandGABA，ITau+GABA)大于單獨(dú)灌流牛磺酸誘發(fā)電流幅度（taurineevokedcurrents，ITau），也大于單獨(dú)灌流GABA誘發(fā)電流幅度（GABAev

18、okedcurrents，IGABA），但是與單獨(dú)灌流?；撬嵴T發(fā)電流幅度與GABA誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandGABA，IEX(Tau+GABA)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)?；撬岷虶ABA誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”;同時(shí)灌流?；撬岷蚲lycine誘發(fā)的電流幅度(actualcurrentsevokedbyacombinationoftaurinean

19、dglycine，ITau+Gly)大于ITau，也大于單獨(dú)灌流glycine誘發(fā)電流幅度(glycineevokedcurrents，IGly)，但是與單獨(dú)灌流?；撬嵴T發(fā)電流幅度與glycine誘發(fā)電流幅度之和(expectedsumofcurrentsevokedseparatelybytaurineandglycine,IEX(Tau+GIy)）之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)?；撬岷蚲lycine誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”。
　

20、　結(jié)論:不同濃度牛磺酸均可激活SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的GABAA-R和glycine-R，這種效應(yīng)是通過介導(dǎo)跨氯離子跨膜流動(dòng)引起的。?；撬崾荊ABAA-R和glycine-R的低親和力激動(dòng)劑。?；撬岵患せ钆d奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的AMPA/NMDA受體。GABA和glycine誘發(fā)電流存在“交叉抑制”，然而?；撬崤cGABA誘發(fā)電流、?；撬崤cglycine誘發(fā)電流之間不存在“交叉抑制”。?；撬釋?duì)GABA/glycine誘發(fā)電流有協(xié)同效應(yīng)。

21、牛磺酸可能通過激活SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的GABAA-R和glycine-R降低神經(jīng)元興奮性，從而拮抗膽紅素興奮毒性。
　　第三部分?；撬嵬ㄟ^激活GABAA-R/glycine-R拮抗膽紅素所致SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核興奮毒性
　　目的:膽紅素腦病會(huì)造成新生兒一過性或永久性的聽力損失，但是目前缺乏有效的治療新生兒膽紅素腦病的藥物。?；撬崾求w內(nèi)含量最豐富的氨基酸之一，主要通過激活GABAA-R和/或glycine-R起到抑制性

22、神經(jīng)遞質(zhì)的作用，也有神經(jīng)保護(hù)作用。既往研究顯示牛磺酸能拮抗膽紅素引起的神經(jīng)元興奮毒性，但是只有形態(tài)學(xué)證據(jù)，缺乏對(duì)電生理機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趶碾娚矸矫嫣剿髋；撬釋?duì)膽紅素所致SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核興奮毒性的抑制作用及其機(jī)制，為臨床治療新生兒膽紅素腦病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:急性單離出生后13-15天的SD大鼠腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元，采用穿孔膜片鉗記錄技術(shù)，在電流鉗模式下，給予細(xì)胞膜0pA的電流刺激，觀察膽紅素對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼?/p>

23、電位發(fā)放頻率的影響。為研究膽紅素對(duì)突觸前谷氨酸釋放的影響，在電壓鉗模式下，將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV，觀察膽紅素對(duì)腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸后電流(spontaneousexcitatorypostsynapticcurrents，sEPSCs)的作用。為探索膽紅素對(duì)突觸后谷氨酸受體敏感性的影響，研究膽紅素、?；撬釋?duì)谷氨酸誘發(fā)突觸后電流（glutamateevokedcurrents，IGlu）的作用。將腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元分為

24、兩組，第一組同時(shí)灌流膽紅素和?；撬幔涗浬窠?jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率;第二組同時(shí)灌流膽紅素、?；撬帷icuculline（GABAA-R阻滯劑）和strychnine（glycine-R阻滯劑），記錄神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率，并比較兩組動(dòng)作電位發(fā)放頻率之間的差異。
　　結(jié)果:在電壓鉗記錄模式下，膽紅素能顯著增加sEPSCs的發(fā)放頻率，膽紅素組sEPSCs發(fā)放頻率為對(duì)照組的640.0±130.1％（P＜0.01，n=6），兩組sEPSC

25、s的幅度無差異（P＞0.05，n=6），證實(shí)膽紅素能促進(jìn)突觸前谷氨酸釋放。在電流鉗記錄模式下，膽紅素誘發(fā)腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢淮罅堪l(fā)放，膽紅素組AP發(fā)放數(shù)量為對(duì)照組的848.0±223.2％（P＜0.01，n=5），沖洗掉膽紅素后，AP發(fā)放頻率仍高于對(duì)照組，為對(duì)照組的623.3±290.9％，但是組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，n=5），證實(shí)膽紅素會(huì)腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元超興奮，這種興奮效應(yīng)即使在沖洗掉膽紅素之后的短時(shí)間內(nèi)仍然存在。膽紅

26、素和?；撬峋挥绊慖Glu的幅度（P＞0.05，n=6），證實(shí)兩者均不影響突觸后谷氨酸受體敏感性。聯(lián)合灌流膽紅素和?；撬?，神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放數(shù)量較單獨(dú)灌流膽紅素組減少（P＜0.01，n=6），沖洗掉?；撬岷?，動(dòng)作電位發(fā)放頻率下降，但是仍高于單獨(dú)灌流膽紅素組（P＜0.05，n=6），證實(shí)膽紅素能減輕膽紅素引起的腹前側(cè)耳蝸核神經(jīng)元超興奮;聯(lián)合灌流膽紅素、?；撬?、bicuculline和strychnine，神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放數(shù)量與單獨(dú)灌流