Tβ4基因在缺氧、炎癥環(huán)境下對骨髓間充質干細胞保護作用的研究.pdf

1、目的:間充質干細胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)主要來源于骨髓,也被少量發(fā)現(xiàn)于其他組織如脂肪、骨膜、牙周韌帶、胎盤等,具有多分化潛能、免疫調節(jié)特性、旁分泌作用等,目前是國內外細胞移植治療心肌梗死的熱點。然而,由于心肌組織壞死后誘發(fā)炎癥反應,加上缺乏氧氣,故心肌梗死處微環(huán)境惡劣,移植細胞凋亡率高。胸腺素β4(Thymosinbeta4,Tβ4),作為一種內源性43個氨基酸肽,研究發(fā)現(xiàn)其有調節(jié)免疫及炎性反應、抗凋亡、

2、促血管再生等作用。本實驗將Tβ4基因轉入BMSCs,觀察是否能夠提高BMSCs在缺氧、炎癥環(huán)境抗凋亡能力,并研究其可能的機制,以期待提高移植BMSCs在心梗部位的生存率。
　　方法:獲取和培養(yǎng)原代BMSCs;構建過表達Tβ4基因的慢病毒載體,將其病毒包裝后轉染BMSCs,轉染完畢后利用Westernblot(WB)檢測Tβ4基因在BMSCs中的表達情況;構建缺氧環(huán)境,然后將細胞分為三組:Tβ4轉染組、對照病毒組、未轉染組,置于缺氧

3、環(huán)境中流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況,WB檢測各組細胞BAX和BCL-2表達情況;構建炎癥環(huán)境,分組同前,流式細胞儀各組細胞凋亡情況,WB檢測各組細胞MMP-9和IL-10表達情況。
　　結果:Tβ4基因質粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜示酶切片段為143bp,與預期相符;菌落PolymeraseChainReaction(PCR)鑒定示陰性轉化子得到198bp片段,陽性轉化子得到333bp片段,表明Tβ4基因已經(jīng)成功插入慢病毒載體中;

4、測序結果與預期相符合;WB示Tβ4轉染組在33KDA處有特征條帶,其大小和Tβ4融合蛋白(5KDA+28KDA)相吻合,而對照病毒組和未轉染組中未檢測到目的蛋白表達,故Tβ4融合GFP共同表達;缺氧處理后流式細胞儀結果示Tβ4轉染組細胞凋亡率較對照病毒組、未轉染組低(P<0.05),WB結果顯示BCL-2表達量Tβ4轉染組高于對照病毒組和未轉染組(P<0.05);BAX表達量Tβ4轉染組低于對照病毒組和未轉染組(P<0.05);炎癥處理

5、后流式細胞儀結果示Tβ4轉染組凋亡率較對照病毒組、未轉染組低(P<0.05),WB示MMP-9表達量Tβ4轉染組低于對照病毒組和未轉染組(P<0.05);IL-10表達量Tβ4轉染組高于對照病毒組和未轉染組(P<0.05);
　　結論:成功構建含有Tβ4基因的慢病毒載體,并在BMSCs中成功表達;上調Tβ4基因在BMSCs中的表達能夠增加其在缺氧中抗凋亡能力,其可能的機制是通過調節(jié)BCL-2和BAX的表達;上調Tβ4基因在BMSC