藥物性耳聾相關線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的建立及應用.pdf

1、耳聾是導致言語交流障礙最常見的疾病,據(jù)世界衛(wèi)生組織2006年估計,全球范圍有2.78億人患有耳聾和其他聽力問題,而據(jù)中國殘疾人聯(lián)會抽樣調(diào)查顯示我現(xiàn)有聽力殘疾的個體超過2057萬,其中7歲以下兒童聽力障礙者80萬。耳聾是由遺傳和環(huán)境因素引起的,其中50％是由遺傳因素造成的。由遺傳因素引起的耳聾包括綜合征型耳聾(占30％)和非綜合征型耳聾(70％),根據(jù)遺傳方式的不同非綜合征型耳聾進一步分為:常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、性染色體遺傳

2、和母系遺傳。調(diào)查顯示,耳聾患者中有3.4％是由個體體質敏感使用了耳毒性藥物而引起,耳毒性藥物如氨基糖甙類抗生素,主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等等。這些藥物原理是與細菌線粒體中核糖體16S rRNA結合,使細菌蛋白質合成異常,進一步導致細菌正常的生理活動受阻,以達到抗菌目的。相關研究證實人類線粒體基因(mtDNA)12S rRNA中A1555G突變和C1494T突變會在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1

3、494U-A1555堿基對,這些改變使得12S rRNA在二級結構上與細菌的16SrRNA的相應區(qū)域的二級結構更加相似,如果用藥本人攜帶這種基因突變,可能就會導致藥物識別錯誤,“攻擊”健康的耳內(nèi)細胞,進而致使耳內(nèi)細胞的蛋白質合成異常,突變攜帶者在接觸氨基糖甙類藥物后便出現(xiàn)了聽力損失的情況。據(jù)測算,我國這些突變的基因攜帶者總數(shù)達到100萬之多,這一群體顯然是預防耳聾的重點對象。但是,目前傳統(tǒng)的檢測技術存在著檢測周期較長,檢測程序較繁瑣、費

4、用昂貴和不易推廣等問題,因此,建立特異、敏感、快速的耳聾相關性線粒體基因的突變診斷技術,不僅能提高診斷流程速度,節(jié)約生物制劑資源,而且能以更有效、更快捷、更科學地預防耳毒性藥物致聾現(xiàn)象的發(fā)生,因此十分具有社會和經(jīng)濟意義。
　　 本研究探索建立了同時檢測耳聾相關的線粒體基因最重要的兩個突變位點A1555G和C1494T的快速診斷方法,并利用本快速診斷方法對浙江省的部分樣品進行檢測。本研究主要包括以下兩部分:
　　 第一部分

5、藥物性耳聾相關的線粒體基因A1555G和c1494T突變快速診斷方法的建立
　　 目前國內(nèi)外傳統(tǒng)的母系遺傳性耳聾基因檢測方法有PCR直接測序、酶切鑒定法、熒光定量PCR檢測等等,雖然檢測方法繁多,其科學性、靈敏性也足夠能保證檢測結果的正確性,但是這些檢測方法也有其固有的自身缺陷,比如試驗過程漫長、檢測步驟冗多、實際操作繁瑣和試劑成本偏高等,因此大范圍地應用于臨床顯得比較不切實際。本研究利用特異性PCR和多重PCR技術建立同時對藥

6、物性耳聾相關的線粒體基因A1555G和C1494T突變的快速診斷方法,其試驗流程簡便快速,結果判讀直觀明了,試劑使用量化節(jié)約,新研究成立的診斷方法應用于檢測線粒體基因A1555G和C1494T突變具備高度的特異性和敏感性。研究運用檢測帶毛囊的毛發(fā)進行試驗,建立起一種對人體無傷害、無痛苦的獲取耳聾患者基因組DNA的方法以及一種快速、簡便、準確、經(jīng)濟的藥物性耳聾相關基因突變檢測方法,以滿足對mtDNA A1555G和C1494T突變進行廣泛

7、篩查的需要。
　　 第二部分藥物性耳聾相關的線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的應用
　　 本研究的對象是浙江溫州和寧波地區(qū)3個攜帶A1555G突變的母系遺傳性耳聾家系和1個攜帶C1494T突變的母系遺傳藥物性耳聾家系,這4個家系均為母系遺傳性耳聾家系,每個家系中均有患者使用過氨基糖甙類抗生素(AmAn)。這兩個家系受檢人數(shù)為19人,同時,我們也選擇了15名無遺傳關聯(lián)的散發(fā)性耳聾患者毛囊樣本,我們分別對

8、這34個標本進行檢測。在試驗過程中,我們使用新建立的藥物性耳聾相關的線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法對全部34名受檢者的標本進行檢測,進行多重等位因特異性PCR擴增,同時,所有被檢者個體的線粒體基因均進行PCR直接測序分析。在所有受檢者中共檢出16例陽性,陽性率為47.1％,并且新診斷方法應用的多重等位基因特異性PCR擴增鑒定檢測結果與直接測序結果完全相吻合,符合度達到100％。由于試驗并不需要投入大量的設備資源和人