藥物性耳聾相關(guān)線(xiàn)粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、耳聾是導(dǎo)致言語(yǔ)交流障礙最常見(jiàn)的疾病,據(jù)世界衛(wèi)生組織2006年估計(jì),全球范圍有2.78億人患有耳聾和其他聽(tīng)力問(wèn)題,而據(jù)中國(guó)殘疾人聯(lián)會(huì)抽樣調(diào)查顯示我現(xiàn)有聽(tīng)力殘疾的個(gè)體超過(guò)2057萬(wàn),其中7歲以下兒童聽(tīng)力障礙者80萬(wàn)。耳聾是由遺傳和環(huán)境因素引起的,其中50％是由遺傳因素造成的。由遺傳因素引起的耳聾包括綜合征型耳聾(占30％)和非綜合征型耳聾(70％),根據(jù)遺傳方式的不同非綜合征型耳聾進(jìn)一步分為:常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、性染色體遺傳

2、和母系遺傳。調(diào)查顯示,耳聾患者中有3.4％是由個(gè)體體質(zhì)敏感使用了耳毒性藥物而引起,耳毒性藥物如氨基糖甙類(lèi)抗生素,主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等等。這些藥物原理是與細(xì)菌線(xiàn)粒體中核糖體16S rRNA結(jié)合,使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成異常,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌正常的生理活動(dòng)受阻,以達(dá)到抗菌目的。相關(guān)研究證實(shí)人類(lèi)線(xiàn)粒體基因(mtDNA)12S rRNA中A1555G突變和C1494T突變會(huì)在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1

3、494U-A1555堿基對(duì),這些改變使得12S rRNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌的16SrRNA的相應(yīng)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加相似,如果用藥本人攜帶這種基因突變,可能就會(huì)導(dǎo)致藥物識(shí)別錯(cuò)誤,“攻擊”健康的耳內(nèi)細(xì)胞,進(jìn)而致使耳內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成異常,突變攜帶者在接觸氨基糖甙類(lèi)藥物后便出現(xiàn)了聽(tīng)力損失的情況。據(jù)測(cè)算,我國(guó)這些突變的基因攜帶者總數(shù)達(dá)到100萬(wàn)之多,這一群體顯然是預(yù)防耳聾的重點(diǎn)對(duì)象。但是,目前傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)存在著檢測(cè)周期較長(zhǎng),檢測(cè)程序較繁瑣、費(fèi)

4、用昂貴和不易推廣等問(wèn)題,因此,建立特異、敏感、快速的耳聾相關(guān)性線(xiàn)粒體基因的突變?cè)\斷技術(shù),不僅能提高診斷流程速度,節(jié)約生物制劑資源,而且能以更有效、更快捷、更科學(xué)地預(yù)防耳毒性藥物致聾現(xiàn)象的發(fā)生,因此十分具有社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
　　 本研究探索建立了同時(shí)檢測(cè)耳聾相關(guān)的線(xiàn)粒體基因最重要的兩個(gè)突變位點(diǎn)A1555G和C1494T的快速診斷方法,并利用本快速診斷方法對(duì)浙江省的部分樣品進(jìn)行檢測(cè)。本研究主要包括以下兩部分:
　　 第一部分

5、藥物性耳聾相關(guān)的線(xiàn)粒體基因A1555G和c1494T突變快速診斷方法的建立
　　 目前國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)的母系遺傳性耳聾基因檢測(cè)方法有PCR直接測(cè)序、酶切鑒定法、熒光定量PCR檢測(cè)等等,雖然檢測(cè)方法繁多,其科學(xué)性、靈敏性也足夠能保證檢測(cè)結(jié)果的正確性,但是這些檢測(cè)方法也有其固有的自身缺陷,比如試驗(yàn)過(guò)程漫長(zhǎng)、檢測(cè)步驟冗多、實(shí)際操作繁瑣和試劑成本偏高等,因此大范圍地應(yīng)用于臨床顯得比較不切實(shí)際。本研究利用特異性PCR和多重PCR技術(shù)建立同時(shí)對(duì)藥

6、物性耳聾相關(guān)的線(xiàn)粒體基因A1555G和C1494T突變的快速診斷方法,其試驗(yàn)流程簡(jiǎn)便快速,結(jié)果判讀直觀(guān)明了,試劑使用量化節(jié)約,新研究成立的診斷方法應(yīng)用于檢測(cè)線(xiàn)粒體基因A1555G和C1494T突變具備高度的特異性和敏感性。研究運(yùn)用檢測(cè)帶毛囊的毛發(fā)進(jìn)行試驗(yàn),建立起一種對(duì)人體無(wú)傷害、無(wú)痛苦的獲取耳聾患者基因組DNA的方法以及一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的藥物性耳聾相關(guān)基因突變檢測(cè)方法,以滿(mǎn)足對(duì)mtDNA A1555G和C1494T突變進(jìn)行廣泛

7、篩查的需要。
　　 第二部分藥物性耳聾相關(guān)的線(xiàn)粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的應(yīng)用
　　 本研究的對(duì)象是浙江溫州和寧波地區(qū)3個(gè)攜帶A1555G突變的母系遺傳性耳聾家系和1個(gè)攜帶C1494T突變的母系遺傳藥物性耳聾家系,這4個(gè)家系均為母系遺傳性耳聾家系,每個(gè)家系中均有患者使用過(guò)氨基糖甙類(lèi)抗生素(AmAn)。這兩個(gè)家系受檢人數(shù)為19人,同時(shí),我們也選擇了15名無(wú)遺傳關(guān)聯(lián)的散發(fā)性耳聾患者毛囊樣本,我們分別對(duì)

8、這34個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。在試驗(yàn)過(guò)程中,我們使用新建立的藥物性耳聾相關(guān)的線(xiàn)粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法對(duì)全部34名受檢者的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行多重等位因特異性PCR擴(kuò)增,同時(shí),所有被檢者個(gè)體的線(xiàn)粒體基因均進(jìn)行PCR直接測(cè)序分析。在所有受檢者中共檢出16例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為47.1％,并且新診斷方法應(yīng)用的多重等位基因特異性PCR擴(kuò)增鑒定檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果完全相吻合,符合度達(dá)到100％。由于試驗(yàn)并不需要投入大量的設(shè)備資源和人