氟喹諾酮類藥物對(duì)糞腸球菌防耐藥突變濃度及分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.在糞腸球菌中建立體外防細(xì)菌耐藥突變濃度（Mutant PreventionConcentration，MPC）的測(cè)定方法，通過測(cè)定4種氟喹諾酮類藥物(FQs)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星對(duì)糞腸球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變體及臨床分離糞腸球菌的最低抑菌濃度(MIC)、防耐藥突變濃度(MPC)和耐藥突變選擇窗(Mutant Selection Window，MSW)，比較不同的氟喹

2、諾酮類藥物的抗菌能力，并結(jié)合已有的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，比較4種藥物的防細(xì)菌耐藥突變的能力。
　　2.探討不同化學(xué)結(jié)構(gòu)、不同濃度的FQ藥物對(duì)耐藥突變株恢復(fù)生長(zhǎng)的影響和在耐藥突變選擇窗(MSW)內(nèi)篩選的細(xì)菌耐藥突變體的分子耐藥機(jī)制。
　　3.結(jié)合MPC、MSW理論、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)(PK/PD)理論對(duì)臨床優(yōu)化氟喹諾酮類藥物的給藥方案提供初步依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用肉湯富集細(xì)菌法富集1010cfu/ml糞腸球

3、菌，采用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂二倍稀釋法測(cè)定4種氟喹諾酮類藥物對(duì)糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變株的最低抑菌濃度(MIC)、MIC99、暫定MPC(MPCpr)及防耐藥突變濃度(MPC)，同時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定和描記細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)曲線，計(jì)算比較ATCC29212及其同源耐藥突變體的耐藥突變選擇窗(MSW)和選擇指數(shù)SI(MPC/MIC)。
　　2.在相應(yīng)藥物的耐藥突變選擇窗內(nèi)篩選細(xì)菌耐藥突變株，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)

4、gyrA和parC的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后進(jìn)行在線Blast比對(duì)，確定其靶位突變位點(diǎn)，并采用外排泵表型抑制試驗(yàn)測(cè)定利血平對(duì)環(huán)丙沙星和加替沙星MIC的影響。
　　3.瓊脂二倍稀釋法測(cè)定4種FQs藥物對(duì)40株環(huán)丙沙星敏感的和15株環(huán)丙沙星耐藥的糞腸球菌臨床分離株的MIC及MPCpr，計(jì)算MIC90、MPCpr90及選擇指數(shù)SI(MPCpr90/MIC90)，比較4種氟喹諾酮類藥物在臨床治療劑量條件下的防耐藥突變能

5、力。
　　結(jié)果：
　　1.4種氟喹諾類藥物對(duì)糞腸球菌ATCC29212的MIC99由低到高為:莫西沙星＜加替沙星＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星，MIC99的結(jié)果提示，莫西沙星的抗菌活性最強(qiáng);加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)糞腸球菌ATCC29212的MPC分別為1.2、1.2、5.6和6.4μg/ml，選擇指數(shù)(即MPC/MIC99)分別為3.4、6、8和8，以加替沙星的選擇指數(shù)最小。糞腸球菌ATCC29212的細(xì)菌恢復(fù)生

6、長(zhǎng)曲線顯示，莫西沙星和加替沙星的平臺(tái)期小于環(huán)丙沙星和左氧氟沙星。
　　2.4種FQs藥物對(duì)糞腸球菌ATCC29212同源第一步突變體的MIC較源菌株ATCC29212升高2～4倍，其他氟喹諾酮類藥物對(duì)其MIC值也有2～4倍的升高，對(duì)加替沙星篩選第二步突變體的MIC較第一步突變體又升高2～4倍。糞腸球菌ATCC29212經(jīng)4種FQs篩選出的第一步耐藥突變體對(duì)環(huán)丙沙星已達(dá)到耐藥，對(duì)左氧氟沙星也達(dá)到了中介耐藥(MIC=4μg/ml)，而

7、對(duì)莫西沙星和加替沙星仍然敏感（MIC:0.5～2μg/ml），但第二步突變體對(duì)莫西沙星和加替沙星也已達(dá)到了中介耐藥(MIC=4μg/ml);4種FQs藥物對(duì)第一步耐藥突變體的MPC值均較ATCC29212源菌株升高2～4倍;加替沙星和莫西沙星對(duì)第一步突變體的MPC值均低于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，對(duì)第二步耐藥突變體的MPC已高達(dá)32μg/ml;加替沙星、莫西沙星和左氧氟沙星對(duì)第一步耐藥突變體的MSW較源菌株增寬。
　　3.根據(jù)4種FQ

8、s對(duì)糞腸球菌ATCC29212的MSW測(cè)定結(jié)果以及加替沙星篩選第二步耐藥突變株，共隨機(jī)篩選了32株同源耐藥突變株，對(duì)該32株同源耐藥突變株的gyrA和parC的QRDR進(jìn)行耐藥突變位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)一步耐藥突變株中均沒有出現(xiàn)堿基位點(diǎn)的突變，而只有加替沙星篩選的第二步耐藥突變株出現(xiàn)了parC的QRDR位點(diǎn)突變，主要是第80位氨基酸密碼子的改變Ser80→Ile(AGC→ATC);利血平抑制實(shí)驗(yàn)提示主動(dòng)外排機(jī)制介導(dǎo)了非靶位改變的耐藥突變株的耐藥

9、性。
　　4.加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)40株環(huán)丙沙星敏感的糞腸球菌臨床分離株的MPCpr90分別為2、1、4和4μg/ml，選擇指數(shù)(SI)分別為4、4、8和8;加替沙星和莫西沙星對(duì)15株環(huán)丙沙星中介耐藥的糞腸球菌臨床分離株的MPCpr90分別為32和16μg/ml，選擇指數(shù)均達(dá)到了32。
　　結(jié)論：
　　對(duì)于糞腸球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變株及糞腸球菌臨床分離株，加替沙星和

10、莫西沙星的抗菌活性均高于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，且加替沙星和莫西沙星限制糞腸球菌耐藥突變體被選擇出來的能力強(qiáng)于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，參照藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星很容易篩選出下一步耐藥突變株，而加替沙星和莫西沙星則能限制下一步耐藥突變株的產(chǎn)生。但對(duì)于第二步耐藥突變株，加替沙星和莫西沙星的MPC增高，MSW增寬，也很容易篩選出對(duì)這兩種藥物也耐藥的菌株。由此可以看出，臨床上為延長(zhǎng)加替沙星和莫西沙星的使用壽命，對(duì)于環(huán)丙沙星已經(jīng)達(dá)到了耐藥的

11、菌株應(yīng)避免再用加替沙星和莫西沙星的單藥治療方案。另外，從本次研究也可以看出，糞腸球菌對(duì)FQs類藥物的耐藥性是逐步產(chǎn)生和發(fā)展的，一旦發(fā)生第一步的耐藥性突變，其MPC值逐漸增高，MSW逐漸增寬，導(dǎo)致第二步耐藥突變體更加容易被選擇出來，只有將第一步耐藥性突變阻斷后，才有可能抑制細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥進(jìn)展，而對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感性下降的糞腸球菌同源耐藥突變株，主要是編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的ParC亞單位基因（parC）發(fā)生了單個(gè)點(diǎn)突變(AGC→A