aac(6’)-Ib-cr基因對氟喹諾酮類藥物耐藥的作用研究.pdf

1、質粒介導的喹諾酮耐藥（PMQR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種介導低水平喹諾酮類藥物耐藥的重要機制，自發(fā)現(xiàn)以來一直是國內(nèi)外關注的熱點。PMQR基因在人源和畜禽源腸桿菌中檢出率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，尤其是同時介導氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物（FQs）耐藥的aac(6’)-Ib-cr基因在大腸桿菌和沙門菌的檢出率在不斷升高。然而，關于aac(6’)-Ib-cr基因在臨床廣泛流行的原因尚未見研究，該基因和其他的喹諾酮耐藥機制如靶位基因突變及外排泵等之間的相互關

2、系在國內(nèi)外也尚未見報道，同時該基因的廣泛流行對菌株耐藥發(fā)展是否存在影響也不清楚。因此，本研究以畜禽源沙門菌為研究對象，分析了沙門菌中PMQR基因尤其是aac(6’)-Ib-cr基因的流行情況，靶位基因突變情況及它們與環(huán)丙沙星敏感性的關系，闡明了aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因與ESBLs基因的協(xié)同傳播機制，著重研究了aac(6’)-Ib-cr基因對喹諾酮耐藥發(fā)展以及對流行的耐藥質粒捕獲的影響，從而進一步闡述了PMQR尤其是aa

3、c(6’)-Ib-cr介導的氟喹諾酮類耐藥機制，為防控畜禽源沙門菌多重耐藥的產(chǎn)生和傳播提供理論依據(jù)。
　　1.畜禽源沙門菌中PMQR基因的流行及其與環(huán)丙沙星耐藥性的關系
　　本研究2014年從我國不同省或市的多個規(guī)?；i場和雞場分離到159株沙門菌，采用玻片凝集法對所有菌株進行血清型鑒定，結果顯示159株沙門菌共有3種血清型：鼠傷寒(n=95)，印第安納(n=63)和腸炎(n=1);采用瓊脂二倍稀釋法測定了菌株對獸醫(yī)臨床常用

4、的6類抗生素的的敏感性，結果顯示畜禽源沙門菌的耐藥現(xiàn)象比較嚴重，對四環(huán)素，氨芐西林，鏈霉素和慶大霉素的耐藥率都超過了80％，對氟喹諾酮類藥物的耐藥率超過了60%，對頭孢噻肟和動物專用藥頭孢噻呋的耐藥率也在50%左右，且全部為多重耐藥。采用PCR及測序的方法檢測PMQR基因的流行情況和靶位基因QRDR的突變情況，并分析PMQR,靶位基因突變以及喹諾酮MIC之間的關系。結果表明，90.6%的沙門菌至少攜帶一種PMQR基因，其中以oqxAB(

5、78%)和aac(6’)-Ib-cr(69%)最為常見并且兩者多共存于同一菌株中。85.5%的菌株發(fā)生靶位基因的突變，以gyrAD87N單突變和gyrA:S83F D87G+ parC:T57S S80R突變組合最為流行，91.8%的aac(6’)-Ib-cr基因陽性菌中檢測到靶位基因的突變，其中54.5%的突變是gyrAD87N單突變。aac(6’)-Ib-cr+oqxAB或aac(6’)-Ib-cr+oqxAB+qnr共存的菌株對環(huán)

6、丙沙星的耐藥率分別為72.1%和95.5%，且多表現(xiàn)為對喹諾酮類藥物較高水平耐藥（MIC≥16mg/L）。在有aac(6’)-Ib-cr+oqxAB基因存在的菌株中，僅gyrAD87N單突變存在時環(huán)丙沙星的MIC≥16mg/L，耐藥水平與多突變的菌株差別不大，說明在這種菌株中環(huán)丙沙星的耐藥水平與突變的個數(shù)不呈正相關。因此在畜禽源沙門菌中aac(6’)-Ib-cr基因流行較高，且常與oqxAB基因及gyrAD87N單突變共存于同一菌株中，

7、對環(huán)丙沙星的高水平耐藥起著重要作用。
　　2.aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB陽性菌株中ESBLs基因的流行及傳播機制研究
　　用PCR和測序方法對aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB陽性菌株中ESBLs基因的流行情況進行調(diào)查,結果表明在144株aac(6’)-Ib-cr和/或 oqxAB陽性菌株有45株檢測到ESBLs基因,全部為blaCTX-M-9G基因,檢出率為31.3%,共有三種亞型,最為流行的是bl

8、aCTX-M-27(n=34),其次為blaCTX-M-65(n=7)和blaCTX-M-14(n=4)。45株blaCTX-M陽性菌株中有35株攜帶oqxAB基因，31株攜帶aac(6’)-Ib-cr基因。采用PFGE,接合轉移/電擊轉化和S1-PFGE、Southern雜交對aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB和blaCTX-M基因的協(xié)同傳播機制進行了研究。PFGE結果顯示這些陽性菌株中存在克隆傳播，從而促進了aac(6’)-

9、Ib-cr和/或oqxAB-blaCTX-M基因的垂直傳播；接合轉移/電擊轉化結果顯示45株blaCTX-M陽性菌株中有38株發(fā)生轉移,且68.4%的陽性菌株發(fā)生aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB共轉移。對質粒特征分析結果表明質粒大小在80~280kb之間，共檢測到5種不同的質粒復制子類型，14株攜帶blaCTX-M-27接合子/轉化子的質粒是不可分型的。結果表明菌株的克隆傳播以及耐藥質粒（P-like質粒）的水平傳播是導致bl

10、aCTX-M基因和aac(6’)-Ib-cr和/或oqxAB基因協(xié)同傳播的重要原因。
　　3.aac(6’)-Ib-cr基因對喹諾酮類藥物耐藥的影響
　　將aac(6’)-Ib-cr基因克隆到質粒載體上，構建重組質粒，然后導入到J53,DH5α以及實驗室構建的鼠傷寒沙門菌標準株SL1344和野生株 SH10的外排泵缺失菌中，測定菌株的MIC、MPC及適應性，并用濃度遞增法誘導菌株耐藥，研究aac(6’)-Ib-cr基因對氟喹

11、諾酮耐藥以及耐藥發(fā)展的影響。結果表明導入攜帶 aac(6')-Ib-cr基因的重組質粒可以使菌株對環(huán)丙沙星的MIC升高2~4倍，MPC增加8~16倍，同時使菌株在共培養(yǎng)時具有競爭優(yōu)勢。在耐藥發(fā)展過程中，在J53及DH5α導入攜帶aac(6')-Ib-cr基因的重組質粒時，并不促進喹諾酮類藥物作用靶位的突變，但增加菌株的突變頻率；另外，在加入外排泵抑制劑后,環(huán)丙沙星的MIC顯著降低，可達32~267倍，顯著高于無aac(6')-Ib-cr

12、基因的菌株。而在SL1344和SH10菌株中，敲除AcrAB-TolC外排泵,不利于菌株的生長和導入重組質粒，在獲得aac(6')-Ib-cr重組質粒的外排泵缺失株的耐藥發(fā)展過程中，發(fā)現(xiàn) aac(6')-Ib-cr可協(xié)同靶位基因以及其他的外排泵提高菌株向高水平耐藥發(fā)展的能力。因此，aac(6')-Ib-cr基因不僅降低菌株對喹諾酮類藥物的敏感性，提高菌株的防突變濃度，增強菌株的競爭能力，而且在喹諾酮類藥物耐藥發(fā)展過程中增加突變頻率，與外

13、排泵機制共同加速高水平耐藥菌株的篩選。
　　4.質粒全測序以及aac(6’)-Ib-cr基因對質粒的影響初探
　　為進一步研究aac(6’)-Ib-cr基因存在時，對菌株捕獲其他耐藥質粒的影響，對上述研究中較為流行的攜帶blaCTX-M-27基因的不可分型的質粒采用高通量測序對其核酸全序列結構特征進行了分析，結果表明攜帶blaCTX-M-27的pSC15質粒大小為103.44kb，是一個P-like（類噬菌體）質粒,與噬菌體

14、P7相似度達73%，質粒上含有大量的噬菌體基因。將pSC15導入到有/無aac(6’)-Ib-cr的菌株中,結果表明在aac(6')-Ib-cr存在時，菌株容易捕獲P-like質粒pSC15，aac(6')-Ib-cr可以補償pSC15的適應性代償，使菌株的生長能力提高，競爭能力增強。該基因的存在可能有利于菌株捕獲其他的耐藥質粒并且提高菌株捕獲其他質粒后的競爭能力，這在一定程度上可以解釋臨床上aac(6')-Ib-cr基因廣泛流行且一般