促炎物質(zhì)誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-37的上調(diào)表達(dá)及其對(duì)Smads信號(hào)通路分子表達(dá)的影響.pdf

1、[目的]
　　 研究促炎物質(zhì)對(duì)單核細(xì)胞IL-37及Smads信號(hào)通路分子表達(dá)的影響，對(duì)IL-37的抗炎作用可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 [方法]
　　 1.分離獲取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，分別用TNF-α和LPS作用PBMCs進(jìn)行促炎物質(zhì)的刺激實(shí)驗(yàn)，以未予促炎物質(zhì)刺激的PBMCs為對(duì)照組，分別用TNF-α和LPS作用PBMCs0.5 h、1h、4h、8h，然后分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)IL-3

2、7及Smads和NF-κB信號(hào)通路分子的表達(dá)水平。另外，分別用1 ng/ml～100 ng/ml等不同濃度的TNF-α和0.01μg/ml～10μg/ml等不同濃度的LPS刺激PBMCs，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)促炎物質(zhì)不同濃度作用PBMCs后，其IL-37及Smads和NF-κB信號(hào)通路分子表達(dá)水平的變化。
　　 2.用佛波酯(PMA)誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1分化為巨噬樣細(xì)胞，以之為靶細(xì)胞進(jìn)行促炎物質(zhì)的相關(guān)刺激實(shí)驗(yàn)，以未予促

3、炎物質(zhì)促炎物質(zhì)刺激的細(xì)胞為對(duì)照組，分別用TNF-α和LPS作用THP-16h、12h、24 h，然后分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)IL-37表達(dá)及Smads和NF-κB信號(hào)通路分子的表達(dá)水平。另外，分別用1 ng/ml～100 ng/ml等不同濃度的TNF-α和0.01μg/ml～10μg/ml等不同濃度的LPS刺激THP-1，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-37及Smads和NF-κB信號(hào)通路分子表達(dá)水平的變化。
　　 [結(jié)果

4、]
　　 1.TNF-α、LPS對(duì)PBMCs IL-37表達(dá)的影響。分別用促炎物質(zhì)TNF-α、LPS刺激PBMCs后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PBMCs經(jīng)30 ng/ml TNF-α作用0.5 h、1h、4h、8h等不同時(shí)間后，IL-37 mRNA的表達(dá)水平逐漸升高。當(dāng)TNF-α刺激PBMCs4 h后，其IL-37 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較具有顯著的差異(P＜0.05）。PBMCs經(jīng)1μg/ml LPS作用0.5

5、h、1h、4h、8h等不同時(shí)間后，IL-37 mRNA呈上升表達(dá)。當(dāng)LPS刺激PBMCs1 h時(shí)，其IL-37 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較具有顯著差異(P＜0.05）;作用4h、8h時(shí)，其IL-37 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，則具有非常顯著的差異(P＜0.01），并隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-37 mRNA的水平呈繼續(xù)上升表達(dá)。不同濃度促炎物質(zhì)刺激PBMCs后的檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-37的表達(dá)水平隨著TNF-α和LPS作用濃度的升

6、高，IL-37的表達(dá)水平逐漸上升。當(dāng)TNF-α濃度為30 ng/ml時(shí)，IL-37表達(dá)至最高水平，高于該作用濃度后，IL-37的表達(dá)水平未見明顯升高;當(dāng)LPS濃度為1μg/ml時(shí)，IL-37表達(dá)至最高水平，隨著LPS作用濃度的繼續(xù)增加，IL-37的表達(dá)水平則未見明顯升高。
　　 2.LPS對(duì)PBMCs Smads信號(hào)通路分子表達(dá)的影響。當(dāng)用1μg/ml LPS作用PBMCs0.5 h、1h、4h、8h等不同時(shí)間后，實(shí)時(shí)熒光定量P

7、CR結(jié)果顯示，當(dāng)LPS分別作用PBMCs0.5 h、1h、4h時(shí)，Smad2的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而作用8h時(shí)則有所下降;Smad3的表達(dá)水平也隨著作用時(shí)間的增高而逐漸升高，作用4h時(shí)，其表達(dá)水平與對(duì)照組相比較才具有顯著差異(P＜0.05); Smad7的表達(dá)則在LPS作用PBMCs1 h時(shí)就顯著升高，與對(duì)照組相比較具有顯著差異(P＜0.05），當(dāng)LPS作用分別上升至4h、8h時(shí)，Smad7表達(dá)水平的升高與對(duì)照組相比較具有非常顯著升高(P＜

8、0.01）。
　　 3.LPS對(duì)PBMCs NF-κB信號(hào)通路分子表達(dá)的影響。當(dāng)用LPS(1μg/ml)刺激PBMCs0.5 h、1h、4h、8h等不同時(shí)間，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，LPS作用PBMCs8 h時(shí)，NF-κB P65表達(dá)水平升高與對(duì)照組相比較具有顯著差異(P＜0.05);在LPS作用PBMCs0.5 h至8h時(shí)，IκBα的水平均呈明顯升高，與對(duì)照組相比較都具有顯著的差異(P＜0.05）;當(dāng)LPS作用PBMCs0

9、.5 h～1 h時(shí)，IKKβ的表達(dá)水平與對(duì)照相比較均具有顯著的差異(P＜0.05)，當(dāng)作用4h時(shí)，則具有非常顯著的差異(P＜0.01），當(dāng)8h時(shí)其表達(dá)水平有所下降，但與對(duì)照組相比較仍具有顯著差異(P＜0.05）。而LPS作用PBMCs后，IKKα表達(dá)盡管有所升高，但與對(duì)照組相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.TNF-α、LPS對(duì)THP-1 IL-37表達(dá)的影響。THP-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞后，分別用TNF-

10、α和LPS進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，當(dāng)用30 ng/ml TNF-α作用THP-1后，IL-37 mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，至作用12h時(shí)，其IL-37 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比較，具有非常顯著的差異(P＜0.01)，作用24 h時(shí)達(dá)最高峰。另外，當(dāng)用不同濃度的TNF-α處理THP-1細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)TNF-α濃度為30 ng/ml時(shí)，IL-37表達(dá)水平達(dá)到最高，之后，IL-37的表達(dá)水平并沒有隨著TNF-

11、α作用濃度的繼續(xù)增高。當(dāng)用1μg/ml LPS刺激THP-1后，IL-37 mRNA水平呈上升表達(dá)，作用12h、24 h與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)。當(dāng)用不同濃度的LPS處THP-1理細(xì)胞，結(jié)果顯示，當(dāng)LPS濃度為1μg/ml時(shí)，IL-37表達(dá)至最高水平，然后IL-37的表達(dá)水平并沒有隨著LPS作用濃度的繼續(xù)增高。
　　 5.TNF-α對(duì)THP-1 Smads信號(hào)通路分子表達(dá)的影響。THP-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)

12、胞后，用TNF-α進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，當(dāng)用TNF-α(30 ng/ml)刺激6h、12h、24 h等不同時(shí)間后，只有刺激24 h時(shí)Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組相比較具有顯著差異(P＜0.05）。而Smad7的表達(dá)水平則在TNF-α作用THP-112 h時(shí)就呈顯著升高(P＜0.05），當(dāng)作用24 h時(shí)，Smad7的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比較則具有非常顯著差異(P＜0.01)。

13、>　　 6.TNF-α對(duì)THP-1 NF-κ B信號(hào)通路分子表達(dá)的影響。THP-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞后，用TNF-α進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TNF-α(30 ng/ml)刺激THP-16h、12h、24 h等不同時(shí)間后，NF-κB P65表達(dá)水平逐漸升高，但在作用24 h時(shí)，NF-κ B P65的表達(dá)水平與對(duì)照組相比較具有顯著差異（P＜0.05）。IκBα的表達(dá)水平在TNF-α作用THP-1后有所升高，至作

14、用24 h時(shí)，其表達(dá)水平的升高與對(duì)照組相比較具有非常顯著的差異(P＜0.01)。IKKα和IKKβ的表達(dá)水平在TNF-α作用THP-1后也呈上升表達(dá)，但只有在作用24 h時(shí)，二者的表達(dá)水平與對(duì)照組相比較才具有顯著的差異(P＜0.05）。
　　 [結(jié)論]
　　 TNF-α和LPS等促炎物質(zhì)能夠上調(diào)單核細(xì)胞IL-37，同時(shí)Smad2、Smad3、Smad7等Smads信號(hào)通路分子也呈上調(diào)表達(dá)且與IL-37上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)基本一致