腫瘤抑制蛋白ARF的一個新結合蛋白NMI的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控ARF蛋白穩(wěn)定性的研究.pdf

1、ARF是一個重要的腫瘤抑制蛋白，編碼ARF的INK4a/ARF基因位點位于人類染色體9p21區(qū)域。INK4a/ARF基因位點的缺失是人類腫瘤發(fā)生過程中最經(jīng)常發(fā)生的事件之一，其在大約40％的人類腫瘤中發(fā)生了缺失和突變，包括惡性黑色素瘤、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、某些類型的白血病、非小細胞肺癌、乳腺癌和膀胱癌。而在結腸癌中，在表觀遺傳水平上ARF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)則發(fā)生了甲基化修飾被沉默。因此，ARF的失活和突變在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。

2、　　 ARF被廣泛認為的最重要的一個功能是參與癌基因誘導的Mdm2/p53依賴性細胞周期檢驗點的調(diào)控。在癌基因活化時，ARF通過激活p53而抑制癌基因造成的細胞過度增殖。在正常情況下，ARF的表達量非常低;但當細胞中癌基因活化時，ARF就被誘導表達。Mdm2是p53的主要負調(diào)控蛋白，ARF通過抑制Mdm2(在人類中為Hdm2)的功能，引起p53依賴的細胞周期阻滯和細胞凋亡。ARF與Mdm2直接結合，從而阻礙Mdm2介導的p53泛素化、

3、核輸出、以及隨后的降解。同時，ARF也被認為可以通過將Mdm2束縛在核仁中而穩(wěn)定核漿中的p53。另外，ARF也可以通過抑制最近發(fā)現(xiàn)的E3泛素化連接酶ARF-BPl/Mule對p53的泛素化降解，而穩(wěn)定p53。除此之外，ARF還通過p53非依賴性途徑發(fā)揮腫瘤抑制功能，如ARF可以與E2F1，c-Myc，NPM/B23，Tip60等蛋白相互作用并調(diào)節(jié)不同的信號通路。
　　 除了參與癌基因活化的感應，研究發(fā)現(xiàn)ARF還參與另外一個重要的

4、細胞檢控點---DNA損傷檢控點（DNAdamagecheckpoint）的調(diào)控。
　　 但在ARF功能與調(diào)控的研究方面仍有許多問題不清楚。其中一個重要的沒有解決的問題是:ARF如何感應癌基因活化和DNA損傷，即癌基因活化和DNA損傷誘導ARF的機制是什么。mRNA的轉(zhuǎn)錄可能在某些情況下調(diào)控ARF的表達;但蛋白翻譯后修飾在ARF的誘導表達中也發(fā)揮關鍵作用。這方面的研究雖然取得了一些積極進展，但仍存在許多問題。為了深入研究ARF的

5、功能和調(diào)控，本論文工作利用酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)了一個新的ARF結合蛋白NMI，并對NMI調(diào)控ARF的功能進行了研究。
　　 首先，本論文工作在293T細胞過表達實驗中驗證了NMI與ARF的結合。接著利用GST-pulldown體外實驗進一步證實了NMI與ARF存在直接結合。為了研究NMI對ARF的調(diào)控，我們構建了H1299-NMI細胞系。有趣的是，在H1299-NMI細胞系中，發(fā)現(xiàn)ARF的表達水平顯著升高。實時定量RT-PCR實驗

6、揭示ARFmRNA水平并沒有發(fā)生變化，因此暗示NMI可能調(diào)控ARF蛋白的穩(wěn)定性。接下來，在p53缺失的H1299非小細胞肺癌細胞和p53野生的人骨肉瘤U2OS細胞中，轉(zhuǎn)染NMI都可以引起內(nèi)源性ARF蛋白的水平上升，這同時說明了NMI對ARF的誘導是p53非依賴性的。通過測定蛋白半衰期，發(fā)現(xiàn)NMI的確增強了ARF蛋白的穩(wěn)定性。為了深入研究NMI如何調(diào)控ARF蛋白的穩(wěn)定性，本論文工作在機理方面進行了探索。我們發(fā)現(xiàn)NMI通過競爭性結合ARF的

7、E3泛素化連接酶ULF，抑制ULF對ARF的泛素化修飾，增強ARF蛋白的穩(wěn)定性。這些是ARF誘導表達機理研究方面的新發(fā)現(xiàn)。本論文工作進一步對NMI調(diào)控ARF的誘導表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)癌基因（如c-Myc、E2F1）活化、DNA損傷和IFNα刺激等細胞脅迫引起NMI水平升高，并伴隨ARF的誘導表達。并且，在MMS處理和IFNα刺激時，NMI能夠從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核中與ARF結合，可能通過向細胞核的轉(zhuǎn)運實現(xiàn)對ARF誘導表達的調(diào)控作用。利用s

8、hRNA降低NMI的表達，發(fā)現(xiàn)MMS處理和IFNα刺激誘導的ARF表達受到了很大程度的抑制。最后，通過細胞增殖實驗和流式細胞術檢測細胞周期分布，本論文工作證實細胞脅迫刺激通過NMI和ARF激活了ATM/Chk2信號通路，使細胞周期阻滯于G2/M期，引起細胞增殖的抑制，這些結果說明了NMI可能在細胞脅迫時ARF的誘導表達中發(fā)揮重要作用。NMI可能在蛋白翻譯后泛素化修飾方面通過ULF調(diào)控ARF的水平。利用這種機制，NMI參與了DNA損傷或癌