甲狀腺轉錄因子-2轉基因小鼠模型建立及其對腭融合的影響.pdf

1、甲狀腺轉錄因子-2(TTF-2)是由titf2/foxel基因編碼，為僅含有一個外顯子的基因，全長為2807bp，定位于鼠4C2。TTF-2蛋白在個體發(fā)生中的表達具有高度組織特異性和發(fā)育階段特異性，其表達受激素和細胞因子調(diào)節(jié)控制。 TTF-2蛋白具有雙向調(diào)節(jié)作用，即TTF-2蛋白的轉錄活化作用和轉錄抑制作用。TTF-2蛋白通過其叉頭DNA結合域與編碼甲狀腺過氧化物酶(TPO)和甲狀腺球蛋白(Tg)基因的啟動子的特殊DNA調(diào)節(jié)序列

2、結合，調(diào)節(jié)Tg和TPO轉錄；TTF-2蛋白通過羧基末端抑制結構域與甲狀腺特異性基因有關的輔助因子(TTF-1、PaX-9)相互作用，特異性抑制其轉錄活化，是啟動子特異性轉錄抑制子。 轉基因動物是將外源基因引入基因組的基因轉移技術，它主要目的是把外源DNA導入動物細胞核內(nèi)改變動物遺傳性狀，是從四維時空觀察轉基因的整體效應，是將外源基因轉移從細胞水平到機體水平的一大飛躍。利用轉基因動物技術可以建立人類疾病相關基因的轉基因動物模型，以

3、探討目的基因的表達調(diào)控規(guī)律。 titf-2-/-小鼠和人類titf-2基因純合缺陷表現(xiàn)為腭裂及甲狀腺發(fā)育不全等畸形。說明titf-2基因與腭發(fā)育有密切關系。但是，目前仍不清楚TTF-2如何控制腭突形成，為詳盡觀察titf-2基因活動規(guī)律和其表達產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的作用，作者設想建立titf-2轉基因小鼠模型“正面”研究的TTF-2的功能。 因titf-2基因僅含有一個外顯子而無內(nèi)含子，本研究首先采取以基因組DNA為模板用PC

4、R方法擴增目的基因片段，從titf-2基因593位點起始密碼子ATG開始至1705位點終止密碼子TGA結束，目的基因片段全長為1113bp。目的基因片段插入T載體，經(jīng)正反雙向測序檢驗正確后，目的基因片段插入轉基因動物專用載體pBROAD3，構建了重組表達載體pBROAD3-titf-2。經(jīng)體外轉染小鼠骨髓間充質(zhì)細胞表達實驗證實本研究構建的pBROAD3-titf-2可以在體外表達TTF-2蛋白，含有結構基因表達所需的元件，完全符合用于轉

5、基因動物的制備。隨后通過顯微注射法，將titf-2基因注射入小鼠受精卵雄原核，經(jīng)PCR和SouthernBlotting，產(chǎn)生轉基因陽性小鼠。 對轉基因胎鼠12、13、14、15天腭突TTF-2和TGFβ3表達的檢測表明：TTF-2在轉基因小鼠腭突中高表達，失去了其原有的時空變化規(guī)律強烈抑制了TGFβ3的表達，導致腭裂形成。 本研究中，我們制備了titf-2轉基因小鼠，該小鼠產(chǎn)生腭裂，進一步研究發(fā)現(xiàn)高表達TTF-2是通過