鬼臼毒素衍生物Z-26-2抗多藥耐藥腫瘤細胞作用及機制研究.pdf

1、目的:探討由實驗室合成的鬼臼毒素衍生物Z-26-2誘導人源多藥耐藥腫瘤細胞K562/A02凋亡在體外的作用效果及機制,為抗腫瘤藥物研制提供理論基礎。
　　 方法:
　　 1 MTT法和SRB法檢測Z-26-2對各種腫瘤細胞增殖/抑制作用。
　　 用96孔培養(yǎng)板接種對數生長期腫瘤細胞,培養(yǎng)24h后,加入不同濃度Z-26-2(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L),48h后以MTT

2、法和SRB法測定Z-26-2在體外對多種腫瘤細胞的IC50或G150值。用SRB法檢測鬼臼毒素新衍生物對K562/A02細胞生長曲線的影響。
　　 2光學顯微鏡、熒光顯微鏡觀察Z-26-2作用后K562/A02細胞形態(tài)結構改變。
　　 在對數生長期的K562/A02細胞中加入不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L),作用于K562/A02細胞24h,Giemsa染色后光學顯微鏡觀察照相并保留結果。同法進行H

3、oechst33342熒光染色,以紫外光(340nm)激發(fā)Hoechst,熒光顯微鏡觀察照相并保留結果。
　　 3瓊脂糖凝膠電泳分析Z-26-2對K562/A02細胞染色體DNA斷裂的影響。
　　 在對數生長期KBV200細胞,加入不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用24h后抽提樣本DNA,于1.5％瓊脂糖膠電泳,電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)照相。VP-16(10μmol/L)為陽性對照。
　　

4、 4流式細胞術分析Z-26-2對K562/A02細胞凋亡率及細胞周期的影響。
　　 對數生長期K562/A02細胞,加入不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)藥物,分別作用12 h、24 h后用流式細胞儀檢測凋亡率以其及對細胞生長周期的影響。
　　 5 RT-PCR法檢測不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)對K562/A02細胞mdr-1、p53、p21、caspase-3 mRNA表

5、達的影響。
　　 結果:
　　 1 Z-26-2的體外抗腫瘤作用。
　　 本課題通過MTT和SRB法實驗發(fā)現Z-26-2對多種腫瘤細胞均有較強的抑制作用。IC50范圍在0.68μmol/L～15μmol/L之間,對skov3的作用最明顯,IC50值達到0.68μmol/L。
　　 從SRB結果可看出:Z-26-2對人紅白血病細胞(K562)及阿霉素誘導的多藥耐藥株(K562/A02)均有抑制作用,其GI5

6、0分別為1.4μmol/L、1.6μmol/L,對多藥耐藥細胞及其母本細胞均有較強的抑制作用。
　　 通過繪制藥物作用K562/A02細胞6天的生長曲線,發(fā)現不同濃度的Z-26-2對K562/A02細胞的生長抑制作用顯著,且呈現較好的量效關系。
　　 2鬼臼毒素衍生物Z-26-2不同濃度組對K562/A02細胞周期的影響
　　 本文采用流式細胞儀分別檢測不同濃度組的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作

7、用12h和24h后對K562/A02細胞周期的影響。結果顯示與空白對照組相比較,不同濃度的Z-26-2在12h、24h時間點都可將細胞周期阻斷在S期。這說明Z-26-2作用12h、24h后,藥物進入細胞核內,并將細胞阻滯于DNA合成期。
　　 3檢測鬼臼毒素衍生物Z-26-2誘導K562/A02細胞的凋亡的效果
　　 把不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02細胞24h后,分別用Gi

8、emsa染液和熒光染料Hoechst33342/PI對細胞進行染色,前者將細胞核染成粉紅色,胞漿染成藍紫色。未加藥組的細胞核染色均一、結構完整、核漿比值大；給藥組細胞可見細胞核形態(tài)呈現細胞凋亡的典型特征:核膜皺縮,核固縮,核碎裂。用熒光染料Hoechst33342對細胞進行染色,在紫外光激發(fā)下發(fā)藍色熒光,熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現K562/A02細胞凋亡的形態(tài)學變化。細胞核染色質發(fā)生聚集、碎裂,細胞膜不斷出芽、脫落,細胞變成數個大小不等的凋

9、亡小體,伴隨著Z-26-2濃度的加大,鏡下具有這種細胞形態(tài)變化的細胞數量愈加明顯,凋亡細胞的比例逐漸增加。并且鬼臼毒素新衍生物濃度的越高,細胞凋亡形態(tài)的變化愈顯著,凋亡細胞的比例愈多,顯示出明顯的劑量依賴性。在經典的DNA降解斷裂檢測實驗中,用不同濃度的Z-26-2分別作用于KBv200細胞24h,提取DNA進行瓊脂糖凝膠電泳,可呈現典型的“DNA梯子樣”圖譜。應用流式細胞儀進行腫瘤細胞凋亡率測定,可見經不同濃度的Z-26-2(μmol

10、/L、2μmol/L)作用于K562/A02細胞24h后,于正常G0/G1細胞群前出現DNA低染細胞群,稱為“A0細胞群”或“亞G1細胞群,Sub-G1”即凋亡細胞群,該現象被認為是細胞發(fā)生凋亡的標志之一,且凋亡細胞的比例隨著鬼臼毒素新衍生物濃度的升高而增大,呈一定的劑量依賴性。綜上結果可以認為鬼臼毒素新衍生物高濃度作用于K562/A02細胞時能夠誘導細胞的凋亡。
　　 4 Z-26-2對K562/A02細胞多藥耐藥性基因mdr

11、-1、凋亡相關基因p53、p21、caspase-3表達
　　 本實驗觀察了Z-26-2對mdr-1基因及凋亡相關基因p53、p21和caspase-3的mRNA表達的影響。經不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02細胞24小時,RT-PCR結果顯示Z-26-2可增加p53、p21、caspase3的mRNA表達,同時降低了mdr-1mRNA的表達,結果同對照組相比均有顯著性差異(P<0.0

12、5),且呈一定的劑量依賴性。提示Z-26-2誘導細胞凋亡的作用極可能依靠上調了p53、p21、caspase-3表達,同時下調多藥耐藥性基因mdr-1 mRNA的表達,從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　 結論:鬼臼毒素衍生物Z-26-2的結構是實驗室首次合成,并通過實驗室體外實驗,證明了其具有顯著的體外抑制多種人源性腫瘤細胞生長的特性,對多藥耐藥腫瘤細胞抑制作用也同樣顯著,根據實驗結果推斷,其主要是將腫瘤細胞生長周期阻斷在S期,能