鬼臼毒素衍生物ZM-16抗腫瘤多藥耐藥作用及其作用機制研究.pdf

1、目的：研究新鬼臼毒素衍生物ZM-16體外抗人源腫瘤細胞多藥耐藥作用及其誘導耐藥腫瘤細胞凋亡的作用，初步探討ZM-16抗腫瘤多藥耐藥作用機制，為抗腫瘤新藥開發(fā)、研制提供理論基礎。
　　 方法：1 MTT法和SRB法檢分別測ZM-16對Hela、Skov3、Lovo、KB、KBv200、K562和K562/A02細胞生長的抑制活性。2以K562/A02和KBv200為研究對象，采用Giemsa染色技術、Hoechst33342/PI

2、熒光雙染技術、瓊脂糖凝膠電泳技術、流式細胞技術觀察了ZM-16誘導K562/A02和KBv200細胞凋亡與作用效果。3 RT-PCR法檢測不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對K562/A02細胞p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax等凋亡相關基因以及mdr-1、topoⅡα、topoⅡβ耐藥相關基因的mRNA表達的影響。4 Western-blot法和免疫細胞化學法檢測不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對K562/A

3、02細胞P-gp表達的影響，初步分析了ZM-16抗腫瘤多藥耐藥的機制。5激光共聚焦檢測不同濃度ZM-16（1μM、4μM）對KBv200細胞微管的影響。
　　 結果：1 MTT實驗發(fā)現(xiàn)ZM-16對多種貼壁腫瘤細胞均有較強的抑制作用，IC50為0.43～20.95μM。從SRB結果可看出：ZM-16對人紅白血病細胞（K562）及阿霉素誘導的多藥耐藥株（K562/A02）均有抑制作用，G150分別為：4.39μM和2.28μM。通過

4、對K562/A02細胞生長曲線的觀察，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ZM-16對K562/A02細胞的生長有明顯的抑制作用，并且具有顯著的量效關系。
　　 2 ZM-16能夠誘導K562/A02和KBv200細胞凋亡。不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細胞24h后，分別用Giemsa染液和熒光染料Hoechst33342/PI對細胞進行染色，前者將細胞核染成粉紅色，胞漿染成藍紫色。未加藥組的細胞核染色均一、結構完整、核

5、漿比值大；給藥組細胞呈現(xiàn)核膜皺縮，核邊集、碎裂。經(jīng)熒光雙染后的細胞在紫外光激發(fā)下發(fā)藍色和紅色熒光，ZM-16可使細胞核染色質發(fā)生聚集、碎裂，細胞膜不斷出芽、脫落，細胞變成數(shù)個大小不等的凋亡小體，并且隨著ZM-16濃度的加大，鏡下具有這種細胞形態(tài)變化的細胞數(shù)量愈加明顯，凋亡細胞的比例逐漸增加。在DNA凝膠電泳實驗中，用不同濃度的ZM-16分別作用于KBv200細胞24h，提取DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，可呈現(xiàn)典型的“DNA梯子樣”圖譜。應用

6、流式細胞儀進行腫瘤細胞凋亡率測定，可見經(jīng)不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細胞24h后，出現(xiàn)一個明顯“亞二倍體峰”，即凋亡峰，且凋亡細胞的比例隨著ZM-16濃度的升高而增加，呈一定的劑量依賴性。
　　 3 用不同濃度的ZM-16分別作用于K562/A02細胞6h和24h，短時間低劑量可使細胞周期阻斷在S期，延長作用時間及增加給藥濃度細胞被阻滯于G2/M期。
　　 4 RT-PCR結果顯示1μM、

7、4μM ZM-16能升高p53、p21、caspase-3 mRNA的水平，同時降低bcl-2、mdr-1 mRNA的水平，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，但對bax、topoⅡα、topoⅡβ作用不明顯。
　　 5 經(jīng)不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于K562/A02細胞48h，Western-blot及免疫細胞化學結果顯示ZM-16可下調P-gp表達，且呈一定的劑量依賴性，Western-blot結果中高劑量組與陰性

8、對照組相比P<0.01。
　　 6 不同濃度的ZM-16（1μM、4μM）作用于KBv200細胞6h后，通過微管免疫熒光法觀察ZM-16對微管以及細胞核形態(tài)的影響，可見對照組的KBv200細胞，微管形態(tài)結構完整，網(wǎng)狀結構清晰，細胞核結構完好；而用1μM ZM-16處理后微管結構受到一定程度的破壞，數(shù)量減少，呈斷片狀，細胞核完整性受到一定影響；高劑量4μM的ZM-16則使絕大部分微管結構破壞，微管不再成束，僅在核周殘留少量彌散點狀

9、不規(guī)則熒光，細胞核內部結構無法呈現(xiàn)。陽性對照藥鬼臼毒素（1μM）處理后的細胞微管不再成束，呈現(xiàn)更明顯的點狀不規(guī)則熒光。高劑量ZM-16處理后的細胞微管形態(tài)變化與鬼臼毒素處理后結果相似。
　　 結論：ZM-16結構新穎、體外抑瘤效果明顯，而且對多藥耐藥腫瘤細胞也有明顯抑制作用；能將腫瘤細胞生長周期阻斷在G2/M期，同時通過影響p53、p21、caspase.3、bcl-2、mdr-1 mRNA及P-gp蛋白水平，抑制細胞微管聚合，