TWEAK-p38 MAPK信號通路在人工關節(jié)假體周圍骨溶解中的作用研究.pdf

1、背景:
　　假體周圍炎性骨溶解是人工關節(jié)置換術后的嚴重并發(fā)癥。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor like weakinducer of apoptosis，TWEAK)是1997年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子配體超家族中的一員。TWEAK在人體多種組織中均有表達，是一種廣泛表達的腫瘤壞死因子家族的配體。多種免疫細胞（單核-巨噬細胞，樹狀突細胞，活化的T細胞等）均可產生其可溶性的細胞因子形式。在急慢性

2、炎癥或損傷的情況下，TWEAK表達顯著增加。已經越來越多研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK通過與其受體相結合，發(fā)揮各種各樣的生物學效應，包括釋放促炎性因子、調節(jié)免疫反應、刺激細胞凋亡以及調節(jié)組織修復與再生。TWEAK能促激活經典的核轉錄因子κ B(Nuclear Factorκ B NF-κB)通路，除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK還可激活非經典的NF-κB通路以及絲氨酸/蘇氨酸絲裂原激活蛋白(mitogen-ativated protein kina

3、se，MAPK)激酶通路。
　　MAPKs信號通路具有生物進化的高度保守性，廣泛存在于細胞內，其主要功能是將細胞外刺激信號傳遞到細胞內，并引起細胞的一系列生物學反應。目前已發(fā)現(xiàn)細胞內有多條MAPK通路:細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulatedkinase，ERK1/ERK2)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路(又稱為應激活化蛋白激酶st

4、ress-activated protein kinase，SAPK)、p38MAPK(p38α，p38β，p38Y and p38δ)通路和ERK3/ERK4/ERK5通路。其中p38MAPK是MAPK家族的重要成員，當他們受到環(huán)境應激或細胞因子刺激時，能使效應細胞產生增殖、分化、遷移、浸潤和炎癥等生命活動。p38 MAPK的抑制劑SB203580，為吡啶咪唑類衍生物，能特異性地作用于p38 ATP結合活性位點Thr106，使p38失

5、去了與ATP結合的能力，從而使其失去激酶活性。
　　白介素-6(Interleukin6，IL-6)是一種多功能的細胞因子，主要由單核細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等分泌，發(fā)揮一系列的免疫效應。單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemiattractant protein1，MCP-1)屬于趨化因子超家族的一員，其主要功能是通過趨化作用，使單核細胞離開血流而分化成為分布于組織中的巨噬細胞，參與著機體的免疫和炎癥反應。研究表明這

6、些因子都參與著關節(jié)置換術后假體周圍無菌性松動的病理過程
　　隨著對炎性骨溶解研究的深入，特別是在溶骨性因子，受體/配體家族成員及其細胞內信號傳導通路對破骨前體細胞分化、成熟及破骨細胞活化、功能影響方面研究的進展，針對骨溶解機制中某一環(huán)節(jié)進行干預成為可能。目前已有少量文獻報道，p38MAPK信號通道參與了磨損微粒誘導的骨溶解這一病理過程，Zwerina等人通過風濕性關節(jié)炎的小鼠模型研究，不僅發(fā)現(xiàn)p38MAPK對于炎性骨破壞起著重要作

7、用，同時還發(fā)現(xiàn)抑制p38MAPK是減輕炎性骨破壞的重要手段。此外，在臨床上對狼瘡腎炎、肌炎等疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK信號通道能被TWEAK激活，并發(fā)揮致病作用。但是p38 MAPK信號通道在人工關節(jié)置換術后假體松動的界膜組織中如何表達，尚存在爭議。而TWEAK作為TNF配體超家族的成員是否也參與假體周圍無菌性松動的發(fā)生和發(fā)展，尚未見文章報道。
　　基于以上的理論支撐，本研究擬通過組織形態(tài)學觀察及分子生物學實驗方法，探討人

8、工關節(jié)假體周圍骨溶解的相關問題。
　　1.在松動假體周圍界膜組織中，TWEAK和p38MAPK表達情況，探討其表達與假體松動的相關性。
　　2.用鈦微粒刺激體外培養(yǎng)巨噬細胞(RAW246.7)，通過p38 MAPK抑制劑進行干預，觀察TWEAK及p38 MAPK的表達，探討TWEAK-p38MAPK信號通過在其中可能的作用機制。
　　3.制備小鼠顱骨骨溶解的動物模型，用p38MAPK抑制劑進行干預，觀察TWEAK及p3

9、8MAPK的表達，探討TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在炎性骨溶解中的作用，以及p38 MAPK抑制劑對人工關節(jié)無菌性松動靶向治療的可能性。
　　一.TWEAK及p38MAPK在關節(jié)松動假體周圍界膜組織中的表達及臨床意義
　　方法:
　　研究不同來源的滑膜組織及松動假體周圍界膜組織（正常滑膜、骨關節(jié)炎滑膜、界膜），通過HE染色和免疫組織化學染色，對組織標本進行定性觀察。通過RT-PCR和West

10、ern Blot等分子生物學實驗方法檢測組織中TWEAK及p38MAPK的表達，對組織標本進行定量觀察。
　　結果:
　　HE染色結果顯示，與正常滑膜組比較，骨關節(jié)炎滑膜組基質和纖維細胞較多，少許炎性細胞浸潤，鏡下見滑膜細胞，但其增生不明顯。而在界膜組中滑膜細胞增生明顯伴有局灶性炎性細胞浸潤，顯微鏡下可見有大量的單核細胞，在細顆粒狀物周圍尤為明顯。TWEAK的免疫組化染色結果顯示，界膜組中可見大量胞質呈棕黃色的單核細胞（陽性

11、細胞）;骨關節(jié)炎滑膜組中可見散在的胞質呈棕黃色的單核細胞;正?；そM中陽性細胞更少。p-p38MAPK的免疫組化染色結果與TWEAK鏡下觀察結果類似。
　　在界膜組的TWEAK mRNA以及蛋白的表達要明顯高于正常滑膜組及骨關節(jié)炎滑膜組，并且骨關節(jié)炎滑膜組的TWEAK mRNA以及蛋白表達水平亦高于正常的滑膜組。p-p38MAPK蛋白表達情況與TWEAK表達類似，在界膜組中最高，關節(jié)炎組次之，正?；そM最少，兩兩比較均由統(tǒng)計學差異

12、。TWEAK和p-p38MAPK表達呈正相關。
　　結論:
　　TWEAK可能是炎性骨溶解的啟動因素之一，p38MAPK可能是參與調控磨損微粒誘導骨溶解的中心環(huán)節(jié)，進一步探索TWEAK及p38MAPK在假體周圍炎性骨溶解中的作用機制，對臨床防治人工關節(jié)無菌性松動具有重要意義。
　　二.p38MAPK抑制劑對鈦微粒刺激巨噬細胞分泌炎性因子的影響
　　方法:
　　體外培養(yǎng)巨噬細胞(RAW246.7)，分組:A組

13、:對照組（細胞單純培養(yǎng)組），B組:A+SB203580（特異性p38MAPK阻斷齊），C組:A+TiPs，D組:A+TiPs+SB203580。將上述各組分別加入24孔培養(yǎng)板，在5％CO2，37℃，95％濕度條件下孵育48小時候收集細胞及細胞培養(yǎng)上清。采用Western Blot分別檢測TWEAK及p-p38MAPK的蛋白表達水平。采用ELISA法分別檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6，MCP-1表達水平。
　　結果:
　　TWEA

14、K蛋白的表達:C組較A組、B組和D組明顯增加(P＜0.05)。且D組較A組B組明顯增加(P＜0.05)。p-p38MAPK蛋白表達:C組明顯高于A組，B組及D組(P＜0.05)。A組明星高于B組、D組(P＜0.05)，B組，D組兩組間沒有明顯差異。細胞培養(yǎng)上清中，IL-6和MCP-1的表達:C組較A組、B組和D組明顯增加(P＜0.05)，A組，B組兩組間沒有明顯差異。
　　結論:
　　鈦微粒能刺激巨噬細胞通過激活p38MAP

15、K信號通路分泌炎性因子，而SB203580能通過抑制p38MAPK，減輕巨噬細胞的炎性因子分泌，因此推測TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在微粒誘導的炎性骨溶解中發(fā)揮著重要作用。進一步探索p38 MAPK信號通路，對臨床防治人工關節(jié)無菌性松動具有重要意義。
　　三.p38MAPK抑制劑對鈦微粒誘導炎性骨溶解的實驗研究
　　方法:
　　雄性C57BL/J6小鼠體重18-22g，12-14周齡。隨機分

16、成:假手術組（A組）、SB203580組（B組）、TiPs植入組（C組）和TiPs植入+SB203580組（D組），SB203580以0.1mg/kg/d腹膜內注射。術后兩周取材，采用TRAP染色觀察骨溶解動物模型里的破骨細胞形態(tài)及數(shù)量，ELISA法檢測動物模型的炎性細胞因子。
　　結果:
　　TRAP染色結果顯示，在C組（TiPs的顱骨模型）可見大量破骨細胞形成，呈紫紅色，散在或者連續(xù)存在。而沒加TiPs的A組和B組中，均

17、沒見到破骨細胞及骨破壞。在D組（TiPs+SB203580的顱骨模型）中，僅在顱骨溶解邊緣有少量紫紅色細胞，陽性細胞較C組明顯減少。顱骨骨破壞也較C組明顯減輕。
　　ELISA結果顯示，C組在鈦微粒的刺激誘導下，TWEAK、p-p38MAPK、IL-6和MCP-1的含量要明顯高于其他三組(P＜0.05)。而D組由于有SB203580的干預，不僅p-p38MAPK得到了明顯的抑制，TWEAK，IL-6，MCP-1表達也明顯減少。與C

18、組相比差異具有統(tǒng)計學意義。其余三組之間差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　SB203580能通過抑制p38MAPK信號通路，降低炎性因子的表達，抑制破骨細胞的生成，減輕鈦微粒誘導的炎性骨溶解。因此，我們認為，TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在微粒誘導的炎性骨溶解中發(fā)揮著重要作用。抑制p38 MAPK信號通路可能成為抑制炎性骨溶解的新途徑，進一步研究p38MAPK信號通路對臨床防治人工關節(jié)無菌性松動具