黃連素對LPS刺激的GMC NF-κB激活及其下游炎癥因子表達的影響.pdf

1、黃連素(Berberine，[C20H18NO4]，又稱小檗堿)是從毛莨科植物黃連(Coptidis rhizoma，CR)、黃柏(Cortex phellodendri)根莖中提取出的一種異喹啉類生物堿。既往研究證實：黃連素具有降低血糖、調節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、抗炎、抗氧化、抑制醛糖還原酶等藥理作用，顯示黃連素作為防治DM及其并發(fā)癥用藥具有一定的臨床價值和應用前景。本文的前期研究發(fā)現(xiàn)黃連素能明顯改善DM腎損傷模型動物的腎功能，抑制腎

2、臟肥大、減少蛋白尿；體外實驗研究表明黃連素可以抑制高糖培養(yǎng)的大鼠GMC增殖和ECM積聚，然其分子作用機理尚不十分清楚。鑒于NF-κB的激活及下游炎癥因子的表達在DN的病理發(fā)展過程中起十分重要作用，黃連素是否能通過抑制NF-κB信號通路及其下游炎癥因子的表達以減輕腎臟炎性反應、改善ECM積聚、發(fā)揮抗DN的綜合效應?值得探討、研究。
　　 本文前期動物實驗研究表明，黃連素對實驗性DN模型具有較好的腎功能保護作用。研究中發(fā)現(xiàn)，黃連素可

3、以減少DN模型腎組織中IκB-α的降解和腎小球細胞核內NF-κB p65的陽性表達，下調ICAM-1，TGF-β1和ECM成分FN的表達。提示DN模型中腎組織NF-κB信號通路被激活，黃連素抗DN作用可能與其抑制NF-κB炎癥信號通路的激活密切相關。然在整體動物模型上，這種作用不排除黃連素降糖作用的間接效應，需進一步明確黃連素不依賴其降糖效應、相對特異性的抑制腎固有細胞NF-κB激活而發(fā)揮抗DN效應的機制。因此本研究中采用炎性刺激脂多糖

4、(Lipopolysaccharide，LPS)刺激的而非高糖培養(yǎng)的大鼠GMC作為研究對象，觀察黃連素對其NF-κB信號通路及其下游炎癥因子ICAM-1、iNOS的影響。
　　 目的：
　　 1.觀察黃連素對LPS刺激的大鼠GMC增殖及ECM的主要成分---FN蛋白表達的影響。
　　 2.觀察黃連素對LPS刺激的大鼠GMC NF-κB炎性信號通路及其下游炎癥因子ICAM-1、iNOS蛋白表達的影響，以深入研究黃連

5、素抗DN炎性損傷的分子機制。
　　 方法：本課題組自行分離、培養(yǎng)、鑒定、穩(wěn)定傳代的SD大鼠GMC，常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，飽和濕度，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天用含0.25％的胰酶消化傳代。
　　 1.實驗分組1)正常對照組(NG)2)細胞炎癥模型組(100 ng/ml LPS，LPS)3)黃連素低劑量(10 μM BBR+100 ng/ml LPS，BL)4)黃連素中劑量(3

6、0 μM BBR+100 ng/ml LPS，BM)5)黃連素高劑量(90 μM BBR+100 ng/ml LPS，BH)6)NF-κB抑制劑組(100 μM PDTC+100 ng/ml LPS，PDTC)實驗用超純水作為溶媒溶解黃連素，用PBS作為溶媒溶解PDTC。
　　 2.MTT比色法檢測黃連素預干預對LPS處理24 h大鼠GMC細胞活力的影響。
　　 3.Western Blot檢測黃連素預干預對LPS處理3

7、0 min，12h和24h大鼠GMCNF-κB p65、IκB-α，ICAM-1、iNOS和FN蛋白表達的影響。
　　 4.免疫熒光染色、激光共聚焦觀察黃連素預干預對LPS處理30 min大鼠GMCNF-κB p65核轉位的影響。
　　 5.亞硝酸酶法試劑盒檢測黃連素預干預對LPS處理24 h大鼠GMC細胞培養(yǎng)液中NO代謝產物NO2-+NO3-的含量變化來反映GMC NO的分泌情況。
　　 結果:
　　

8、1.黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC細胞活力的影響。MTT法觀察細胞活力的變化，結果發(fā)現(xiàn)終濃度為100 ng/ml的LPS處理24 h可以明顯促進大鼠GMC增殖(P＜0.05)；黃連素預干預12 h后與LPS同處理24h能夠劑量依賴性的抑制LPS誘導的大鼠GMC增殖(P＜0.05)；其中90μM的劑量達到較理想的抑制效應，最后選擇10，30，90μM三個劑量進行實驗；而用黃連素對未加LPS刺激的大鼠GMC進行干預36 h，結果發(fā)現(xiàn)1

9、0-90μM的黃連素對正常培養(yǎng)的大鼠GMC的細胞活力沒有明顯的影響，說明本文選的三個劑量對細胞是沒有毒性的；100 μM的NF-κB特異性抑制劑PDTC能顯著抑制LPS誘導的大鼠GMC增殖(P＜0.05)。
　　 2.黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC FN蛋白表達的影響。LPS可顯著誘導腎小球系膜FN的蛋白表達上調，與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組對LPS誘導的GMCFN蛋白表

10、達增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導的GMC FN蛋白表達的作用。
　　 3.黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC NF-κB激活的影響。
　　 3.1 Western Blot結果顯示：LPS刺激30 min可明顯誘導GMC細胞核中NF-κBp65的蛋白表達增加、細胞漿中NF-κB p65的蛋白表達減少，與正

11、常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組與模型組相比，胞核中NF-κB p65的蛋白表達減少、胞漿中NF-κB p65蛋白表達增加，以黃連素中、高劑量組及PDTC組作用顯著，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制細胞漿中NF-κB p65向細胞核轉位的作用，并呈一定的量效依賴關系。
　　 3.2 IκB-α是NF-κB的抑制性蛋白，胞漿中IκB-α的磷酸化降解可促

12、進NF-κB p65的核轉位。LPS刺激30 min即可引起GMC胞漿中IκB-α蛋白的降解，與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組對LPS誘導的GMC胞漿IκB-α蛋白的降解具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用顯著，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗結果與胞漿/胞核p65的蛋白表達結果相吻合，提示黃連素通過抑制IκB-α的降解、減少p65的轉位入核，從

13、而抑制NF-κB的激活。
　　 3.3 免疫熒光染色，激光共聚焦定位觀察可見：正常對照組細胞核未見NF-κB p65的熒光染色；經LPS刺激30 min后，LPS刺激組細胞核密布NF-κB p65的熒光染色；黃連素預干預組細胞核散在NF-κB p65熒光染色;PDTC組細胞核極少見NF-κB p65的熒光染色。免疫熒光染色，激光共聚焦觀察佐證了黃連素具有抑制LPS刺激的GMC NF-κB p65核轉位的作用。
　　 4.

14、黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC炎癥因子表達的影響。
　　 4.1 黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC ICAM-1蛋白表達的影響LPS干預12 h即可顯著誘導GMC ICAM-1的蛋白表達上調，與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組對LPS誘導的GMC ICAM-1蛋白表達增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0

15、.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導的GMC的炎癥粘附分子ICAM-1蛋白表達的作用。
　　 4.2 黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC iNOS蛋白表達的影響正常狀態(tài)下，GMC幾乎不表達iNOS蛋白，LPS干預12 h即可顯著誘導GMC iNOS的蛋白表達上調，與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組對LPS誘導的GMC iNOS蛋白表達具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和P

16、DTC組抑制作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導的GMC炎性酶iNOS蛋白表達的作用。
　　 5.黃連素預干預對LPS刺激的大鼠GMC NO生成的影響。一氧化氮的半衰期極短，無法直接檢測NO的生成量，因此檢測細胞培養(yǎng)液中NO代謝產物NO2-+NO3-的含量變化來反映NO的變化情況。LPS處理24 h可引起細胞培養(yǎng)液中NO2-+NO3-含量顯著升高，與正常對照組比差異具有統(tǒng)計學意

17、義(P＜0.05)；黃連素各劑量預干預組、PDTC組對LPS誘導的GMCNO分泌增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組抑制作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示黃連素在抑制LPS誘導的GMC炎性酶iNOS蛋白表達的基礎上，具有明顯抑制NO生成增加的作用。
　　 結論：LPS能顯著誘導大鼠GMC增殖與FN蛋白高表達，激活大鼠GMC NF-κB信號通路及其下游炎性黏附因子ICAM-1、炎