納米雄黃制備及誘導(dǎo)U937腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、砷劑在治療血液腫瘤方面已取得了令人矚目的成績，尤其是近年來對急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的治療已得到世界的公認(rèn)，目前用于治療APL的砷化合物主要是雄黃和As2O3。本課題組近年來開發(fā)的復(fù)方黃黛片對急性早幼粒細(xì)胞白血病的完全緩解率達(dá)98.6％。其中君藥雄黃為硫化物類礦物雄黃族雄黃，主要成分為四硫化四砷，難溶于水，在胃腸道僅極少部分被吸收。隨著納米技術(shù)在中醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用，已有研究證明納米技術(shù)可以改變雄黃的理化性質(zhì)、增加其水溶性，從而達(dá)到減

2、毒增效的用藥目的。為了進(jìn)一步完善納米級雄黃的制備工藝，提高其生物利用度，本文對納米雄黃粉體(nanoparticlerealgarpowders，NRP)的制備工藝、分析方法及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 主要對納米雄黃粉體的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了納米雄黃粉體的粒度分析研究方法，并對納米雄黃粉體在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了初步研究。同時(shí)本文也深入研究了PI3-K/Akt和SIRT1/p53途徑在納米雄黃粉體誘導(dǎo)U9

3、37細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。 在對納米級雄黃制備工藝進(jìn)行優(yōu)化研究的實(shí)驗(yàn)中，我們利用溫度可控惰性氣體高能球磨機(jī)來制備納米級雄黃粉體，采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，對球料比(4：1～16：1)、球磨轉(zhuǎn)速(23～38Hz)、球磨時(shí)間(4～16h)、球磨介質(zhì)去離子水量(10～150mL)、球磨溫度(-20～10℃)等球磨參數(shù)進(jìn)行五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備納米級雄黃的最佳工藝參數(shù)為球料比16：1、球磨轉(zhuǎn)速38Hz、球磨溫度

4、-20℃、球磨時(shí)間12h、去離子水量取50mL。 采用掃描電鏡和原子力顯微鏡對納米雄黃表觀形貌進(jìn)行直接觀察測定，用激光光散射法對納米雄黃的粒度分布范圍進(jìn)行分析測定。經(jīng)掃描電鏡、原子力顯微鏡和激光散射顆粒度測定儀的測量，結(jié)果表明經(jīng)上述優(yōu)化工藝制備的納米雄黃制劑粒徑在100nm以下的達(dá)90％，其中較大顆粒是由粒徑在5～30nm左右的細(xì)小晶粒和其周圍的非晶體聚集而成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，掃描電鏡法、原子力顯微鏡法和激光光散射法快速、簡便、準(zhǔn)

5、確，可用于納米雄黃的粒度檢測。 小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果：納米雄黃中砷在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為符合開放性血管外給藥一室模型一級速率過程；納米雄黃與傳統(tǒng)水飛雄黃的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有顯著差異(P<0.05)；與傳統(tǒng)水飛雄黃相比，納米雄黃中砷達(dá)峰時(shí)間早、峰濃度高、AUC大，在體內(nèi)吸收快，消除慢，藥物在體內(nèi)維持時(shí)間長。 體外活性實(shí)驗(yàn)證明：納米雄黃可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞NB4、HL-60、K562及U937產(chǎn)生凋亡，對U937

6、作用尤為明顯，本文對PI3-K/Akt和SIRT1/p53途徑在納米雄黃粉體誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用進(jìn)行了深入討論。將20，40，60，80或100μg/mL的NRP作用于淋巴瘤U937細(xì)胞12，24，36或48小時(shí)，通過MTT法檢測到NRP誘導(dǎo)U937細(xì)胞的死亡成一定時(shí)間和濃度依賴性。熒光顯微鏡下細(xì)胞呈明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞膜出泡、細(xì)胞核濃縮且有顆粒狀的凋亡小體出現(xiàn)。采用乳酸脫氫酶活力(LDH)實(shí)驗(yàn)，測定凋亡和壞死細(xì)

7、胞的比例，20～80μg/mLNRP作用U937細(xì)胞24h，凋亡的細(xì)胞顯著增加，而壞死的細(xì)胞沒有顯著的變化且仍低于10.8％，當(dāng)NRP的濃度增加至120μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞比率開始明顯下降，壞死細(xì)胞比率開始明顯增加，結(jié)果表明NRP誘導(dǎo)U937細(xì)胞的死亡過程是一個(gè)介于細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死之間的平衡過程。我們采用流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot方法相結(jié)合，檢測了PI3-K/Akt途徑對NRP誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PI3-

8、K/Akt途徑對細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，而NRP通過抑制PI3-K/Akt途徑的活化從而促進(jìn)了U937細(xì)胞的凋亡。我們采用MTT法和Westernblot方法進(jìn)一步考察了SIRT1和p53在NRP誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用，結(jié)果表明NRP活化了p53，而SIRT1的抑制劑sirtinol進(jìn)一步增強(qiáng)了p53的活化。且Westernblot結(jié)果顯示，P13-K的抑制劑wortmannin對SIRT1的表達(dá)有明顯的抑制作用，從而增強(qiáng)