酒精對神經(jīng)前體細胞的作用及細胞內信號通路的影響.pdf

1、一、背景： 患有酒精綜合癥(fetal alcohol syndrome)的兒章是在胚胎期和(或)哺乳期由母親過量飲酒行為引起，有明顯小于健康兒童的大腦及其他畸形。為研究在胎兒期大腦皮層神經(jīng)細胞在增殖、分化過程中受酒精損傷的原理，用培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞(neural progenitor cells)建立實驗模型，以研究酒精對生長因子刺激引起神經(jīng)前體細胞數(shù)量擴增的影響。該模型的建立可幫助了解酒精綜合癥對神經(jīng)系統(tǒng)(central nervo

2、us system，CNS)損傷的機制，為保護暴露于酒精危害下胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供預防及治療的科學依據(jù)。 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSC)培養(yǎng)技術的發(fā)展，為體外研究神經(jīng)干細胞增殖、分化特性及神經(jīng)干細胞損傷保護提供了重要的實驗手段。國外已有報道貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的方法，與傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞懸浮培養(yǎng)相比，更適于研究酒精對神經(jīng)前體細胞增殖、分化的影響，如免疫熒光染色、細胞計數(shù)等。 另外，在神經(jīng)干細胞

3、克隆球超微結構觀察中發(fā)現(xiàn)，在克隆球中相鄰的兩個細胞膜之間有成片的連接，有2-4nm狹窄的縫隙，為間隙連接(gap junction)。構成這種細胞間通道的蛋白質分子被稱為連接蛋白(connexin)或者連接子(connexon)。連接蛋白基因是一個多基因家族，與神經(jīng)干細胞的增殖分化有關。確定神經(jīng)干細胞克隆球細胞之間連接蛋白的類型，可幫助了解神經(jīng)干細胞在體外培養(yǎng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育過

4、程中間隙連接的演變過程及其規(guī)律。 國外新近報道，神經(jīng)前體細胞株在分化過程中能夠分泌某種抑制神經(jīng)膠質瘤生長的因子。本試驗對神經(jīng)干細胞分化過程中產生的衍生物對神經(jīng)膠質瘤細胞的抑制作用作了初步的探討，為今后治療神經(jīng)膠質瘤提供新的思路和方法。 二、目的： 建立神經(jīng)干細胞貼壁培養(yǎng)方法和研究酒精損傷神經(jīng)干細胞實驗模型，并探討酒精對神經(jīng)前體細胞的作用及細胞內信號通路，為開展研究孕期酒精對胎兒神經(jīng)干細胞的損傷及對策提供實驗依據(jù)

5、： 分析懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞克隆球中相鄰細胞之間的連接方式，為了解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中連接子的變化規(guī)律提供實驗依據(jù)： 探討神經(jīng)干分化過程中產生的衍生物對神經(jīng)膠質瘤細胞的抑制作用，為臨床神經(jīng)膠質瘤的治療提供新的思路。 三、方法： 本試驗以Wistar大鼠13.5-14天胚胎大腦皮層細胞為試驗材料，用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液于37℃、5％CO<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)細胞。 1、用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液原代貼壁培養(yǎng)

6、細胞5天，用nestin熒光抗體對其進行鑒定并計數(shù)確定神經(jīng)干細胞陽性比率；用BrdU摻入實驗證明貼壁培養(yǎng)細胞的增殖能力。 2、貼壁培養(yǎng)5天神經(jīng)前體細胞，進行分組試驗：在培養(yǎng)液中分別加入終濃度為25mM、50mM、100mM及200mM的酒精，作用24小時，加入PI和Ho.33342熒光探針，標記正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞，確定不同濃度的酒精導致的神經(jīng)前體細胞死亡方式；并根據(jù)不同濃度的酒精對無bFGF和加入bFGF培養(yǎng)條件的

7、細胞進行試驗分組，分別統(tǒng)計細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)。 3、貼壁培養(yǎng)5天神經(jīng)前體細胞，加入不同濃度的酒精24小時后，用激光共聚焦顯微鏡Ca離子成像法檢測細胞內Ca離子含量的變化：用流式細胞技術檢測細胞內磷酸化Akt含量的變化，以確定酒精抑制神經(jīng)前體細胞增殖作用相關的細胞信號通路。 4、用透射電鏡技術對原代培養(yǎng)5天的神經(jīng)干細胞克隆球進行超微結構觀察，并用Cx43及Cx32熒光抗體對克隆球中間隙連接蛋白進行鑒定，確定細胞間

8、連接蛋白的成分。 5、以全反式視黃酸誘導神經(jīng)干細胞克隆球向神經(jīng)元分化，與C6細胞共培養(yǎng)，并收集神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)上清液加入C6細胞培養(yǎng)液中，在倒置相差顯微鏡下觀察C6細胞的增殖狀態(tài)，從形態(tài)學角度初步探討神經(jīng)干細胞分化衍塵物對膠質瘤細胞生長抑制作用。 四、結果： 1、經(jīng)免疫熒光技術鑒定，貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)前體細胞，95％以上為nestin及BrdU陽性細胞，說明在該培養(yǎng)體系中95％以上的細胞仍處于原始的未分

9、化狀態(tài)，并且具有增殖能力。 2、PI及Ho.33342熒光染色結果顯示，酒精濃度達到200mM時，貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞大部分出現(xiàn)壞死，中低濃度酒精則出現(xiàn)細胞凋亡及細胞數(shù)量減少的情況。 3、通過BrdU摻入實驗和細胞計數(shù)證實，(1)酒精能夠抑制bFGF介導的細胞增殖，并有濃度依賴性；(2)酒精能夠抑制神經(jīng)前體細胞在沒有bFGF刺激的情況下的自發(fā)增殖。后者的作用可能與凋亡細胞的增多有關。 4、用激光共聚焦顯微鏡C

10、a<'2+>成像法半定量檢測細胞內Ca<'2+>濃度和用流式細胞儀定量檢測細胞內Akt的含量的變化發(fā)現(xiàn)，(1)酒精明顯減少生長因子信號通路的Ca<'2+>濃度；(2)酒精能夠減少bFGF引起的Akt的磷酸化。結果提示：酒精抑制bFGF誘導的細胞增殖與RTK下游PLC及P13K兩條信號轉導途徑有關。 5、用Cx43及Cx32熒光抗體對克隆球中細胞間隙連接蛋白進行鑒定：神經(jīng)干細胞克隆球細胞間存在間隙連接，其連接蛋白主要成分為連接蛋白

11、43(connexin43，Cx43)，而連接蛋白Cx32為陰性。對比分化后的神經(jīng)元，Cx43及Cx32均呈陰性。結果提示間隙連接中的連接蛋白Cx43與神經(jīng)干細胞的增殖分化有關。 6、倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質瘤C6細胞，細胞形態(tài)呈細長梭形，生長速度很快。加入含有神經(jīng)干細胞分化衍生物的培養(yǎng)液及與正在分化的神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)后，C6細胞增殖速度減慢，細胞形態(tài)由細長梭形變?yōu)楸馄蕉嘟切危毎麛?shù)量下降，生長速度明顯受到抑制。

12、 五、結論： 通過免疫熒光技術對貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞鑒定證實，貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)細胞中，95％的細胞仍具有干細胞的特征，處于未分化狀態(tài)及保持增殖能力，是用來研究神經(jīng)干細胞增殖、分化特性及其損傷保護理想的實驗材料。酒精對神經(jīng)前體細胞損傷作用主要有兩種機制：細胞死亡和細胞周期的延長。酒精濃度達到200mM時，神經(jīng)前體細胞大部分出現(xiàn)壞死，中低濃度酒精可以誘導神經(jīng)前體細胞細胞凋亡，從而造成細胞數(shù)量減少。酒精對bFGF誘導的神經(jīng)前體

13、細胞增殖和自發(fā)增殖均有抑制作用，并有濃度依賴性。 酒精明顯減少生長因子信號通路的Ca<'2>濃度及減少bFGF引起的Akt的磷酸化提示：酒精抑制bFGF誘導的細胞增殖與RTK下游PLC及P13K兩條信號轉導途徑有關。 神經(jīng)干細胞克隆球細胞之間存在間隙連接，主要成分為連接蛋白C×43；分化后的神經(jīng)元不表達連接蛋白Cx43，證實連接蛋白Cx43在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化過程中有重要意義。 神經(jīng)干細胞在分化過程中產生的