以BMP-2為靶點的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型的優(yōu)化及應用.pdf

1、　　本研究室初步建立了一個以bmp-2啟動子為藥物作用靶點、熒光素酶為報告基因的藥物篩選模型，其通過測定模型熒光強度而間接反映藥物上調(diào)活性，屬瞬時轉染細胞篩選模型。本論文以此為基礎，從細胞量、轉染方式、轉染時PYJ質(zhì)粒的DNA量與脂質(zhì)體量的比例、轉染后至檢測熒光素酶表達量的最適時間等方面優(yōu)化模型的篩選條件。　　為了使模型更適合高通量篩選，且更為簡便、經(jīng)濟、易于操作，我們將模型從瞬時轉染模型改建為穩(wěn)定轉染模型。然后對穩(wěn)定轉染模型的細胞量

2、、藥物作用時間等進行了優(yōu)化。通過對比瞬時轉染模型和穩(wěn)定轉染模型，我們發(fā)現(xiàn)后者可完全取代前者，且更經(jīng)濟、節(jié)約實驗成本和實驗時間，熒光素酶表達測量值更穩(wěn)定，變異系數(shù)更易控制在10％以下?！　±迷Ｐ秃透倪M的穩(wěn)定轉染模型，我們篩選了5000個微生物發(fā)酵液粗提品，500個合成化合物，對初篩陽性物進行五次復篩，選出高上調(diào)率的2個陽性合成化合物2009481、2009111和1株稀有放線菌5195。通過半定量RT-PCR驗證了2009111可促

3、人MG63細胞的BMP-2mRNA的表達。用流式細胞分析技術也檢測到2009481、2009111可在蛋白水平促人MG63細胞的BMP-2表達。2009481為蒽酮類化合物，2009111為紅景天甙類化合物，為抗骨質(zhì)疏松藥物的研發(fā)提供了新方向，其藥理和毒理活性值得進一步研究?！　ο∮蟹啪€菌5195進行擴大發(fā)酵、提取分離得到5195的活性組分，并測得其活性組分濃度在3μg/mL左右能較大幅度提高篩選模型的熒光活性。5195可在蛋白水平