臍帶間充質(zhì)干細胞對重度燒傷大鼠腎臟及肺保護作用的研究.pdf

1、嚴重燒傷可造成全身多臟器損傷和功能下降,特別是燒傷合并多器官功能障礙綜合征,是導致病人死亡的主要原因。雖然燒傷后各器官結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機制仍然不完全明了,但諸多研究表明,燒傷后局部微環(huán)境改變與組織器官修復和再生關系密切;特別是缺血、缺氧及炎性介質(zhì)大量釋放和氧自由基產(chǎn)生是導致多器官功能衰竭的重要原因。目前已有研究表明在受損后應用間充質(zhì)干細胞可以有效改善損傷局部微環(huán)境,從而促進細胞活性以及修復損傷組織。間充質(zhì)干細胞(mesenchyma

2、l stem cells,MSCs)是具有增殖和多向分化潛能的一類多能干細胞,可從胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪等多種組織獲得,是一群多潛能細胞,可以向多種組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)細胞增殖分化。臨床上利用MSCs移植治療某些疾病也已取得較好效果。
　　目前,在針對組織再生與修復的各項研究中,自體骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow derived-MSCs,BMMSCs)的研究和應用最為廣泛,在體修復損傷組織的

3、技術(shù)方法已經(jīng)建立及得到應用。然而,骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取須行骨髓穿刺術(shù),給供者造成一定痛苦,且骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及分化潛能隨供者年齡的增大而下降。而且以往對MSCs的應用在損傷組織再生修復研究中僅限于后期的治療,在急性燒傷等需早期治療中往往受到細胞培養(yǎng)周期的限制而無法及時使用。因此尋找新的MSC來源成為國內(nèi)外干細胞研究領域的熱點。目前,臍帶來源間充質(zhì)干細胞(umbilical cord derived-MSCs,UCMSCs)的多向

4、分化潛能已得到證實,而且具有來源廣泛、免疫反應低、分化潛能大等多種優(yōu)勢,因此,可以將UCMSCs作為一種嶄新的細胞治療策略應用于燒傷后器官損傷修復再生研究。
　　嚴重燒傷所導致的不同臟器損傷的發(fā)生與發(fā)展與嚴重程度也不盡相同,其中腎臟組織損傷是較早出現(xiàn)的并發(fā)癥。腎臟組織損傷的發(fā)生與多種細胞因子、嘌呤池耗竭、自由基的生成增多和清除能力減弱、能量代謝障礙、細胞凋亡和壞死等多種因素的作用有關。近期研究表明MSCs能夠參與炎癥組織的細胞遷移

5、,并通過產(chǎn)生多種再生因子,引起組織及浸潤在黏膜內(nèi)活化的巨噬細胞失活,并通過促進宿主自身細胞增殖修復損傷組織。這也提示UCMSCs可能對早期重度燒傷動物具有較好的保護效應。為探討UCMSCs在嚴重創(chuàng)傷后具體器官或組織中的具體作用以及其機制,本研究采用重度燒傷大鼠模型,觀察UCMSCs對傷后腎臟可能產(chǎn)生的作用,為UCMSCs應用于燒傷后腎臟損傷的保護及機制研究奠定基礎。另外,燒傷后的急性肺損傷是傷后導致的急性進行性缺氧性呼吸功能不全,也是導

6、致患者死亡的主要原因。但由于肺部結(jié)構(gòu)的復雜性和易感染性,目前干細胞用于治療肺部疾病的研究落后于其他器官。已有文獻證實腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性介質(zhì)的合成釋放,中性粒細胞等在肺內(nèi)積聚,補體激活,氧自由基產(chǎn)生等所導致的一系列病理改變在其發(fā)病機制中起重要作用?；诖?本研究采用燒傷與細菌感染的雙重模型,試圖探討UCMSCs對創(chuàng)傷后急性肺損傷的保護效應及可能機制。本研究結(jié)果有望為干細胞應

7、用于燒傷后臟器的損傷保護及其機制研究奠定實驗基礎。
　　本實驗主要由以下三部分內(nèi)容組成:
　　一、分離培養(yǎng)獲取UCMSCs及對其細胞生物學特性實驗研究。在本實驗中,采用膠原酶消化與組織貼壁相結(jié)合的方法,分離獲取臍帶沃頓膠(Wharton’s Jelly)來源的間充質(zhì)干細胞,采用流式細胞術(shù)檢測細胞的表面抗原的表達、分析細胞的增殖活性;同時采用細胞化學法鑒定細胞的多向分化潛能(脂肪、骨及軟骨細胞)。結(jié)論:臍帶沃頓膠(Wharto

8、n’Jelly)中分離、提取的UCMSCs陽性表達間充質(zhì)干細胞標記物抗原(CD29、CD44、CD90、CD105),陰性表達造血細胞系標記物CD34。UCMSCs能夠分化為堿性磷酸酶染色陽性的骨細胞、II型膠原抗體染色陽性的軟骨細胞以及油紅-O染色陽性的脂肪細胞。經(jīng)四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測法發(fā)現(xiàn),UCMSCs具有較強的細胞增殖能力。
　　二、UCMSCs對重度燒傷大鼠

9、腎臟保護作用的研究。
　　在本實驗中,取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20％總體表面積(total body surface area,TBSA)III度燒傷大鼠模型:其中以烏斯他汀治療為陽性對照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對照組。燒傷后大鼠模型愈合后,用冰凍切片法與免疫組織化學染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠腎臟中分布特征,生化試驗檢測其修復治療的治療效果。結(jié)論:經(jīng)與陽性對照組、陰性對照組比較后發(fā)

10、現(xiàn),燒傷后7、14d的組織病理學觀察顯示,干細胞移植后的大鼠燒傷后腎臟組織充血、腫脹等病理學改變較烏司他丁組及生理鹽水組有所減輕,隨時間延長減輕更加明顯;免疫組化觀察顯示UCMSCs組傷后7d和14d腎組織中Bcl-2的表達較烏司他丁組和生理鹽水組明顯增多,表明腎組織抗凋亡能力增強。大鼠燒傷后血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)均較正常對照組顯著升高。烏司他丁治療組7d和14dB

11、UN和Cr較生理鹽水組均明顯下降。UCMSCs組傷后7d和14dBUN和Cr均明顯下降,與生理鹽水組和烏司他丁組比較差異均有顯著性(P<0.05),顯示干細胞治療對腎功能有明顯改善作用。UCMSCs移植可有效減輕重度燒傷后大鼠腎臟組織的損傷并改善腎臟功能。
　　三、UCMSCs對創(chuàng)傷后早期急性肺損傷作用的研究
　　在本實驗中取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20%TBSAIII度燒傷大鼠模型(注射大腸桿菌內(nèi)毒素

12、):其中以烏斯他汀治療為陽性對照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對照組、注射UCMSCs為實驗組。采用冰凍切片法與免疫組織化學染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠肺中分布特征,生化試驗檢測其修復治療的治療效果。結(jié)論:經(jīng)與陽性對照組、陰性對照組比較后發(fā)現(xiàn),燒傷后7、14d的組織病理學觀察顯示,臍帶間充質(zhì)干細胞能改善創(chuàng)傷性急性肺損傷動物的血氣,不同程度降低外周血TNF-α及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavag