豬源附紅細(xì)胞體分離鑒定PCR方法的建立及小附紅細(xì)胞體人工感染試驗(yàn).pdf

1、感染豬的附紅細(xì)胞體分為附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體兩大類。而國(guó)內(nèi)還未見有關(guān)小附紅細(xì)胞體分離和動(dòng)物感染試驗(yàn)的報(bào)道。通過(guò)小附紅細(xì)胞體病原的分離鑒定及動(dòng)物感染試驗(yàn)，有助于了解小附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性及致病性。
　　本試驗(yàn)從上海地區(qū)2個(gè)屠宰場(chǎng)，采集豬抗凝血736份，提取血液基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物并驗(yàn)證了具有高度敏感性和良好特異性，用兩對(duì)特異性的引物進(jìn)行16s RNA基因部分序列的PCR擴(kuò)增、克隆、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

2、。結(jié)果顯示，在736份血樣中，豬源附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為13.72％(101/756)，其中小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為7.34％(54/736)，豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為4.76％(35/736)，混合感染比例為1.63％(12/736)，2個(gè)屠宰場(chǎng)3次采集的樣品陽(yáng)性率差異極顯著（x2=132.841，P＜0.001）。嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)3月份的陽(yáng)性率為2.41％，5月份的陽(yáng)性率為33.21％，5月份極顯著高于3月份（x2=81.484，P＜0.001）

3、。
　　在DNA擴(kuò)增陽(yáng)性血樣中，分別選取4份小附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物和4份豬附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物，亞克隆到pMD18-T載體后進(jìn)行測(cè)序。小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列完全一致，長(zhǎng)度均為483 bp，BLASTn軟件在線分析顯示所獲得序列與GenBank公布的小附紅細(xì)胞體Indiana株16S rRNA基因（登錄號(hào):NR_121759）序列同源性達(dá)100％。豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列也完全一致，長(zhǎng)度均為482 bp，BLASTn軟件在線分

4、析顯示所獲得序列與GenBank公布的豬附紅細(xì)胞體Morioka5、6、8株16S rRNA基因（登錄號(hào)分別為:AB610847、AB610848、AB610849）和ZJ NB01株16SrRNA基因（登錄號(hào):KC907396.1）序列同源性達(dá)100％，豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段與小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段的同源性僅為93.6％。
　　用小附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血樣通過(guò)肌肉注射方法接種廣西巴馬去脾仔豬，采集血樣進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)及序列分析。結(jié)果表