牛、豬附紅細胞體病診斷方法的建立及粘附機制研究.pdf

1、附紅細胞體（Eperythrozoon）是一類附著于人和動物紅細胞表面，或者游離于血漿中的不可培養(yǎng)的病原微生物。此類病原的感染會引起急性溶血性貧血從而對宿主致死，或者引起輕微的慢性貧血，宿主表現(xiàn)為生長發(fā)育不良，不孕和免疫抑制等，從而給畜牧業(yè)帶來巨大的經濟損失。雖然至今已經建立了一系列附紅細胞體的診斷技術，但是不同的診斷方法各有其優(yōu)缺點，因此需要建立更加敏感、高效、準確的附紅細胞體檢測方法。另外，關于附紅細胞體與紅細胞之間的具體粘附機制研

2、究仍然是空白，因此對附紅細胞體粘附相關蛋白進行篩選以及功能研究對于闡述此種病原的致病機制就顯得尤為重要。
　　鑒于以上原因，本研究首先建立了溫氏附紅細胞體的環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法，利用該方法對國內部分地區(qū)的溫氏附紅細胞體的流行情況進行了調查，同時也對可能的傳播媒介中溫氏附紅細胞體的存在情況進行了檢測;隨后建立了基于豬附紅細胞體MSG1蛋白的間接ELISA方法，并進行了初步的臨床應用;之后從豬附紅細胞體的基因組信息中選擇

3、了五個可能的粘附相關蛋白，對這五個蛋白與豬紅細胞膜之間的粘附能力進行了研究。
　　(1)溫氏附紅細胞體環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法的建立及應用
　　根據GenBank中溫氏附紅細胞體16SrRNA基因序列設計一對檢測溫氏附紅細胞體的PCR引物F3、B3，建立PCR檢測方法;同時設計一組特異性檢測溫氏附紅細胞體的LAMP引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，建立LAMP檢測方法。敏感性試驗結果顯示，LAMP方法比P

4、CR方法的敏感度高出十倍。利用建立的兩種方法同時對來自全國部分地區(qū)共330份牛血液樣品進行了檢測，LAMP方法檢測出了71份陽性樣品，而PCR方法僅檢測出了62份陽性樣品，且所有PCR方法檢測陽性的樣品均為LAMP檢測陽性。通過測序對9份PCR檢測陰性但LAMP檢測陽性的樣品進行了分析，結果證實此9份樣品均為溫氏附紅細胞體感染。此外，利用兩種檢測方法同時對牛棚中采集的17只蜱、24只虱子、25只蚊子、22只蠅進行了溫氏附紅細胞體的檢測，

5、結果顯示PCR和LAMP方法均在7只蜱、13只虱子、16只蚊子、以及22只蠅中檢測到了溫氏附紅細胞體的存在。此結果提示此類節(jié)肢動物作為附紅細胞體傳播媒介的可能性。
　　(2)基于溫氏附紅細胞體16SrRNA基因進化樹的構建
　　通過將部分溫氏附紅細胞體陽性樣品的16SrRNA基因全長序列進行克隆測序，得到8條來自于河南(HN)、江蘇(JS)、湖北(HB)、四川(SC)、安徽（AH）等地的溫氏附紅細胞體16SrRNA基因序列。

6、將此八條序列與Genbank中所下載的其他血營養(yǎng)型支原體相關序列用MEGA軟件采用鄰接法建立進化樹。通過進化樹可以看出，所獲得的八條序列均位于溫氏附紅細胞體的分支上，不同的地理分離株之間沒有明顯的差異，而相對于豬附紅細胞體來說，溫氏附紅細胞體與羊附紅細胞體的親緣關系更為接近，所有的血營養(yǎng)型支原體構成了一個獨立的分支，并且與肺炎支原體比較接近。
　　(3)豬附紅細胞體間接ELISA檢測方法的建立及初步應用
　　根據Genban

7、k中豬附紅細胞體(MycoplasmasuisMSG1基因序列(GenBankID:AM407404.1)為靶基因設計了一對可以擴增豬附紅細胞體MSG1基因主要抗原決定部位的PCR引物，經過克隆測序后，將此段基因插入原核表達載體pET28a，之后進行MSG1蛋白的原核表達。通過對IPTG誘導時間以及誘導濃度進行優(yōu)化，最終確定MSG1重組蛋白原核表達的最佳條件，在此條件下進行MSG1蛋白的大量提取。利用提取的MSG1重組蛋白建立了檢測豬附

8、紅細胞體的間接ELISA方法，且此方法具有良好的特異性及重復性。將建立的間接ELISA方法進行了初步的臨床應用，初步檢測結果顯示成年豬中豬附紅細胞體感染的抗體陽性率明顯高于小豬。
　　(4)豬附紅細胞體粘附蛋白的篩選
　　從Genbank中公布的豬附紅細胞體基因組文庫中選擇了五個假定粘附蛋白，分別用粘附ELISA試驗以及血涂片粘附試驗對這五個蛋白的粘附效果進行了比較。為了讓這五個蛋白能夠在大腸桿菌表達系統(tǒng)中順利表達，先進行了

9、堿基點突變試驗優(yōu)化其密碼子;之后利用表達的重組蛋白制備多克隆抗體血清，隨后進行了多抗血清IgG的純化以及生物素標記;粘附ELISA結果顯示，GAPDH蛋白具有最強的粘附于豬紅細胞膜的能力，其次為OSGEP蛋白;粘附抑制試驗說明此兩種蛋白的多抗血清能夠特異性的阻斷其粘附作用;五個蛋白的大腸桿菌亞細胞定位結果顯示，此五個重組蛋白分別在大腸桿菌的菌膜和菌質中均有表達;血涂片粘附試驗結果與粘附ELISA結果吻合，表達GAPDH蛋白以及OSGEP