靈芝屬菌株特異性分子標(biāo)記的研究.pdf

1、靈芝在我國已有悠久的應(yīng)用歷史，可用于多種疾病的治療。近年來，靈芝的栽培生產(chǎn)得到迅速發(fā)展，靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是我國的靈芝生產(chǎn)用菌種非?；靵y，存在同種異名、同名異種的現(xiàn)象，使得靈芝的基礎(chǔ)科研與相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨許多困難。 本研究的目的是尋找靈芝屬菌株的特異性分子標(biāo)記，建立靈芝屬菌株快速、有效的檢測(cè)與鑒定方法，為靈芝菌種的鑒定提供一種新的、快速準(zhǔn)確而且費(fèi)用較低的鑒定方法，為我國保護(hù)靈芝菌種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)提供有效檢測(cè)手段及技術(shù)標(biāo)

2、準(zhǔn)。 本實(shí)驗(yàn)以152株靈芝屬菌株(包括128株來自中國的栽培菌株及24株國外菌株)為材料，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已完成的ERIC-PCR親緣聚類分析結(jié)果，把相似度水平在0.850以上的菌株構(gòu)成一個(gè)DNA池，共建成48個(gè)DNA池。 用SRAP引物對(duì)48個(gè)DNA池進(jìn)行擴(kuò)增，篩選獲得1個(gè)SRAP特異性標(biāo)記；用ISSR引物對(duì)48個(gè)DNA池進(jìn)行擴(kuò)增，篩選獲得3個(gè)ISSR特異性標(biāo)記?；厥者@些特異性條帶，經(jīng)克隆測(cè)序后設(shè)計(jì)了4對(duì)SCAR引物，分別

3、為C4A/C4S，C38A/C38S，C39A/C39S，C45A/C45S(C39A/S是通過SRAP獲得，另外三個(gè)是通過ISSR獲得)。通過SCAR-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，將SRAP標(biāo)記和ISSR標(biāo)記均成功的轉(zhuǎn)化為特異性和穩(wěn)定性更好的SCAR標(biāo)記。 將得到的4個(gè)SCAR標(biāo)記在構(gòu)成DNA池的152個(gè)菌株上驗(yàn)證。為了保證驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，每次都以特異性菌株為陽性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果顯示從C4，C38，C39和C45中獲得的特異性SCAR標(biāo)記在實(shí)

4、驗(yàn)所用的所有菌株中擴(kuò)增都是只對(duì)應(yīng)一個(gè)菌株，分別是G0014，G0121，G0142和G0126。說明這四個(gè)標(biāo)記都是針對(duì)單一菌株的特異性分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了SCAR特異標(biāo)記在菌株快速檢測(cè)鑒定中的可行性和可靠性。 在篩選到的4個(gè)SCAR標(biāo)記中，因有兩個(gè)標(biāo)記C4(777bp)和C38(774bp)片段大小只相差3bp，在瓊脂糖電泳中不能區(qū)分，因此我們用篩選到的4個(gè)SCAR標(biāo)記建立了兩個(gè)多重PCR體系，實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)可檢