四川地區(qū)1株虹鱒(Oncorhynchus mykiss)源傳染性造血器官壞死病毒的分離鑒定.pdf

1、2013年，四川成都彭州某冷水魚養(yǎng)殖場(chǎng)虹鱒暴發(fā)一種流行性傳染病，具有發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn)（幼魚和魚苗死亡率分別高達(dá)40％和80％）。對(duì)送檢樣品進(jìn)行剖解和組織病理學(xué)觀察。典型表觀臨床癥狀表現(xiàn)為體色發(fā)黑，腹部膨大，體表多處出現(xiàn)瘀點(diǎn)，病程長(zhǎng)的病魚肛門到尾鰭基部大面積出血，吻部潰爛、出血，部分病魚眼眶充血，肛門處流出淡黃色粘液便。剖解后可見(jiàn)膘膜、腹膜、心包膜、腦膜、脂肪組織嚴(yán)重點(diǎn)狀出血，肝臟發(fā)白，脾臟發(fā)黑腫大，腎臟腫大、淤血，部分病魚可見(jiàn)心臟

2、出血點(diǎn)，胃脹氣膨大，腸道呈明顯的出血性-卡他性炎，腸壁變薄，剖開(kāi)胃和腸道可見(jiàn)透明淡黃色粘液。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)頭腎、腎、腸道、脾和肝臟等器官的損傷非常顯著。典型病理變化表現(xiàn)為頭腎實(shí)質(zhì)大面積變性、壞死;腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)造血組織壞死;腸道腸粘膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，粘膜下層聚集大量壞死的嗜酸性顆粒細(xì)胞;脾廣泛變性、壞死，巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)，肝細(xì)胞變性，壞死形成局灶性的壞死灶，并在肝細(xì)胞胞漿發(fā)現(xiàn)包涵體。其臨床癥狀和典型的病理

3、組織損傷與傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）感染類似。
　　參照Williams等的方法合成三對(duì)檢測(cè)虹鱒病毒性疾病的引物，針對(duì)IHNV、傳染性胰腺壞死（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）與出血性敗血癥病毒(viralhemorrhagic septicemia virus，VHSV)的多重RT-PCR檢

4、測(cè)顯示自然發(fā)病魚為IHNV陽(yáng)性，測(cè)序后的擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，擴(kuò)增序列與IHNV核蛋白(Nucleoprotein，N)基因同源性為99.9％。取病魚的肝、脾組織研磨過(guò)濾菌后接種到鯉魚上皮瘤細(xì)胞（epithelioma papulossum of carp，EPC），盲傳3代出現(xiàn)典型的壞死，脫落，形成空斑等細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）。并將病變細(xì)胞懸液腹腔注射20尾健康虹鱒，注射組均

5、表現(xiàn)為急性死亡（累計(jì)死亡率=75％），試驗(yàn)魚出現(xiàn)與自然發(fā)病魚相同的癥狀而對(duì)照組無(wú)異常。提取病變細(xì)胞和人工感染病毒的RNA進(jìn)行多重RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示位于約371bp處均可見(jiàn)特異性DNA擴(kuò)增條帶，與IHNV預(yù)期大小一致。本節(jié)利用鯉魚上皮瘤細(xì)胞從患病虹鱒分離了一株傳染性造血器官壞死病毒，命名為L(zhǎng)QN131107，經(jīng)人工感染試驗(yàn)和多重RT-PCR鑒定進(jìn)一步確定該病的病原是IHNV。
　　參考GenBank中IHNV核蛋白基因開(kāi)放閱

6、讀框（open reading frame，ORF）的序列（登錄號(hào):KJ441078）設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得IHNV-LQN131107株核蛋白全長(zhǎng)基因，純化后克隆至pMD19-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:IHNV-LQN131107株核蛋白基因的序列長(zhǎng)度為1176 bp，編碼391個(gè)氨基酸殘基，富含亮氨酸(11.80％)、丙氨酸(10.50％)、谷氨酸(9.50％)、甘氨酸(9.20％);包含1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，

7、為Rhabdo_ncap_2;核蛋白不含有信號(hào)肽，不存在跨膜區(qū)，親水性大于疏水性;抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其抗原性良好;修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，存在1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)、3個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)和18個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。參照Kolodziejek等的方法合成一對(duì)擴(kuò)增部分糖蛋白基因的引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得糖蛋白基因，純化后克隆至pMD19-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)軟件構(gòu)建糖蛋白“Mid-G”基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，LQN131107株與