脂氧素A4對ARDS肺水清除和炎癥細胞的影響及機制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：脂氧素A4對健康志愿者與膿毒癥患者中性粒細胞的影響及機制
　　目的：比較脂氧素對健康志愿者與膿毒癥患者中性粒細胞的影響異同并探討其可能機制。
　　方法：分別抽取40位健康志愿者和膿毒癥患者血液分離中性粒細胞。脂氧素干預中性粒細胞1h后，以N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLP)和Interleukin(IL)-8為趨化劑檢測中性粒細胞的

2、趨化作用，檢測中性粒細胞凋亡情況，檢測中性粒細胞細胞內吞噬作用和細胞外吞噬作用(細胞外誘捕NETs)，檢測中性粒細胞活性氧的產生，細胞表面標記分子的表達以及COX-2，NF-κB蛋白表達情況。探討并比較脂氧素A4對健康志愿者和膿毒癥患者中性粒細胞的影響及具體機制。
　　結果：與空白對照組比較，脂氧素A4抑制志愿者和膿毒癥患者的趨化作用;促進4h，24h中性粒細胞的凋亡;促進中性粒細胞吞噬細菌能力和胞外誘捕能力;抑制活性氧的產生;降

3、低細胞表明粘附分子CD11a，CD16，CD63和內毒素受體CD14的表達;脂氧素A4抑制志愿者和膿毒癥患者中性粒細胞COX-2，NF-κB/P-P65的蛋白表達。脂氧素對膿毒癥患者的作用較健康志愿者更強，提示脂氧素在炎癥發(fā)生后促進炎癥消退的作用更顯著。
　　結論：脂氧素通過調控中性粒細胞的趨化，凋亡，吞噬，活性氧產生，細胞表面標記分子，COX-2，NF-κB/P-P65的蛋白表達，提示脂氧素A4可通過調控NF-κB信號通路發(fā)揮炎

4、癥消退的作用。
　　第二部分：脂氧素A4對人原代肺泡巨噬細胞的影響及機制
　　目的：研究脂氧素對人原代肺泡巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞以及巨噬細胞表型轉化的影響并探討其可能機制。
　　方法：取來自30多位肺癌患者切除的肺組織，0.9％生理鹽水灌洗肺組織后分離肺泡巨噬細胞。不同劑量脂氧素A4(10，50，100，150，200 nM)，不同劑量HMGB1(10，50，100，150 ng)，脂多糖(lipopolysacc

5、haride，LPS)，BOC-2(脂氧素受體抑制劑，10μM)或LY294002(PI3K抑制劑，10μM)分別干預肺泡巨噬細胞24 h，96 h后，將CMFDA Green標記的凋亡的中性粒細胞加入巨噬細胞中(4∶1)共培養(yǎng)90min后，流式細胞術檢測凋亡率。巨噬細胞表面標記分子標記M1，M2型，流式細胞術檢測脂氧素對肺泡巨噬細胞表型轉化的影響。
　　結果：與空白對照組比較，脂氧素A4組時間-劑量依賴性促進人原代肺泡巨噬細胞吞

6、噬凋亡的中性粒細胞（P＜0.05）;與空白對照組相比，LPS抑制肺泡巨噬細胞吞噬率，HMGB1時間-劑量依賴性抑制肺泡巨噬細胞吞噬率（P＜0.05）;與LPS組相比，脂氧素A4治療組促進肺泡巨噬細胞吞噬率（P＜0.05）;與HMGB1組相比，脂氧素A4治療組促進肺泡巨噬細胞吞噬率（P＜0.05）;給予BOC-2(脂氧素受體抑制劑，10μM)或LY294002(PI3K抑制劑，10μM)后，脂氧素作用消失;治療性給予脂氧素A4上調P-P8

7、5蛋白表達。脂氧素還可促進肺泡巨噬細胞和單核細胞來源的巨噬細胞M1型向M2型轉化，進而促進炎癥消退。
　　結論：脂氧素一方面通過脂氧素受體(ALX)----HMGB1---PI3K通路介導肺泡巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞，促進炎癥消退;另一方面，脂氧素通過調控肺泡巨噬細胞從促進炎癥發(fā)生的M1型向促進炎癥消退的M2型轉化，發(fā)揮炎癥消退的作用。
　　第三部分：脂氧素A4對ARDS大鼠肺泡液體清除率的影響及機制
　　目的：研究

8、脂氧素對大鼠急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)肺泡液體清除率的影響并探討其可能機制。
　　方法：在體實驗部分，雄性SD大鼠(250-300 g)麻醉氣管插管后，靜脈給予0.03 ml/kg油酸建立急性呼吸窘迫綜合征模型后，脂氧素A4(2 ug/kg)、BML-111(脂氧素受體激動劑，1 mg/kg)或BOC-2(脂氧素受體抑制劑，600 ng/kg)經(jīng)股靜脈注入

9、大鼠體內，隨之5％Evans Blue-標記的白蛋白(5 ml/kg)經(jīng)氣管導管緩慢泵入左肺，機械通氣1h后，腹主動脈放血處死動物。光鏡下觀察肺組織病理學變化，測定肺組織TNF-α，髓過氧化物酶(MPO)，cAMP，cGMP含量;測定濕干重比值;回抽左側肺組織灌注液測定AFC;檢測肺組織勻漿鈉通道(ENaC)，Na，K-ATPase蛋白表達量以及Na，K-ATPase活性。此外，分離培養(yǎng)大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮(ATⅡ)細胞，脂氧素A4(1

10、0-7 mol/L)與內毒素(lipopolysaccharide，LPS1 ug/ml)干預細胞檢測ENaC蛋白和mRNA表達量以及Na, K-ATPase活性。
　　結果：在體實驗中，與OA組比較，脂氧素A4治療組，BML-111預防組和治療組肺組織中性粒細胞浸潤減少、肺水腫減輕;肺組織TNF-α，MPO含量，濕干重比值明顯降低(P＜0.01); AFC明顯升高（P＜0.01）;肺組織ENaCα，γ亞基和Na，K-ATPase

11、β1亞基蛋白表達明顯增高(P＜0.05); Na，K-ATPase活性明顯增強(P＜0.01）;肺組織勻漿中cAMP含量未明顯變化（P＞0.05），但是cGMP含量明顯降低（P＜0.05）;給予Rp-cGMP(cGMP抑制劑，15μM)后，AFC增高;而給予BOC-2后，上述變化均消失。大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮細胞中，與LPS(1ug/ml)組比較，脂氧素A4(10-7 mol/L)治療組ENaCα，γ亞基蛋白表達明顯增高，ENaCγ亞基m