水稻代謝數(shù)量性狀位點(diǎn)研究及代謝相關(guān)基因克隆.pdf

1、植物代謝物對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境和人類營(yíng)養(yǎng)等都非常重要。水稻是世界上主要的糧食作物之一，同時(shí)也是單子葉植物的模式生物。對(duì)水稻代謝組進(jìn)行遺傳分析，鑒定代謝相關(guān)的基因功能，進(jìn)一步解析代謝途徑，有利于改善水稻對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性、改良稻米品質(zhì)、提高水稻產(chǎn)量。
　　代謝數(shù)量性狀位點(diǎn)(mQTL)的研究是以代謝物的積累水平作為數(shù)量性狀進(jìn)行QTL定位，分析控制代謝物含量變異的遺傳位點(diǎn)。本論文主要利用以珍汕97和明恢63為親本構(gòu)建的重組自交系(R

2、IL)群體，對(duì)不同組織和不同時(shí)期的材料進(jìn)行代謝取樣，以一種廣泛定向代謝組的分析方法進(jìn)行了檢測(cè);以基于重組bin標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖進(jìn)行了mQTL定位，獲得了大量定位區(qū)間小、解釋效應(yīng)大的mQTL;用導(dǎo)入系(IL)對(duì)mQTL結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證;將不同水平的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，輔以生物信息學(xué)分析的手段，篩選了一批控制代謝性狀的候選基因，并對(duì)部分基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證;對(duì)水稻中相關(guān)的代謝途徑進(jìn)行了重構(gòu)和完善。本論文主要結(jié)果如下:
　　1.檢測(cè)方法

3、的驗(yàn)證以本室建立的基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)平臺(tái)的研究方法，對(duì)RIL群體的親本ZS97、MH63和部分種質(zhì)資源進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能很好地用于實(shí)驗(yàn)材料的分類，能同時(shí)檢測(cè)近一千種代謝物，具有很好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，可以進(jìn)一步用于水稻群體大規(guī)模、高通量的代謝組分析。
　　2.不同組織的mQTL研究在水稻抽穗期劍葉和發(fā)芽72 h種子中分別檢測(cè)了683個(gè)和317個(gè)代謝物，其中100個(gè)是兩個(gè)組織共同檢測(cè)到的。以1，619個(gè)重組

4、bin標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖進(jìn)行mQTL定位，劍葉中的617個(gè)代謝性狀共定位到1，884個(gè)mQTL，發(fā)芽種子中的302個(gè)代謝性狀共定位到837個(gè)mQTL，兩個(gè)組織都定位到一些置信區(qū)間很小和解釋效應(yīng)很大的位點(diǎn)。對(duì)兩個(gè)組織中共同檢測(cè)的代謝物及其定位到的mQTL進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)代謝物的積累模式在不同組織間存在很大差異，代謝物的含量也存在著復(fù)雜的遺傳調(diào)控模式。
　　mQTL并不是隨機(jī)分布在各個(gè)染色體上，在劍葉的第1、第6、第7、第1

5、0染色體和發(fā)芽種子的第5、第6染色體上出現(xiàn)了明顯的富集。以1 cM為窗口統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間內(nèi)mQTL的數(shù)目，在劍葉和發(fā)芽種子中分別鑒定了44個(gè)和16個(gè)mQTL熱點(diǎn)。選取最靠近mQTL熱點(diǎn)的重組bin，對(duì)所有已知物質(zhì)進(jìn)行兩位點(diǎn)互作分析，發(fā)現(xiàn)了代謝性狀的調(diào)控中存在顯著的兩位點(diǎn)互作。以ZS97為受體，MH63為供體的ILs，檢測(cè)了64個(gè)代謝物，其中有55個(gè)代謝物的主效mQTL的效應(yīng)得到了證實(shí)。結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，篩選了24個(gè)候選基因（9個(gè)為新

6、基因），包括一些控制重要農(nóng)藝性狀和生物學(xué)過程的基因，并在此基礎(chǔ)上重構(gòu)和完善了水稻相關(guān)的代謝途徑。
　　3.不同時(shí)期的mQTL研究對(duì)水稻三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行了代謝組檢測(cè)。在成熟期種子、發(fā)芽72 h種子和灌漿期種子中分別獲得了810，836和855個(gè)代謝物的數(shù)據(jù)，其中372個(gè)為三個(gè)時(shí)期共同檢測(cè)過的物質(zhì)。三個(gè)時(shí)期中都有一半以上的代謝性狀的變異系數(shù)超過50％，表明RIL群體不同發(fā)育時(shí)期種子的代謝組都存在很大差異。在成熟種子、發(fā)芽種子

7、和灌漿種子分別定位到了1，506，1，575和1，600個(gè)mQTL，并分別檢測(cè)到42個(gè)、39個(gè)和39個(gè)mQTL熱點(diǎn)。
　　比較三個(gè)時(shí)期共同檢測(cè)的372個(gè)代謝物，發(fā)現(xiàn)各類別的代謝物在不同時(shí)期都表現(xiàn)出不同的緊密程度。分析這372個(gè)代謝物的mQTL，成熟種子中有303個(gè)物質(zhì)定位了共746個(gè)mQTL，發(fā)芽種子中有311個(gè)物質(zhì)定位了共692個(gè)mQTL，灌漿種子中有290個(gè)物質(zhì)定位了共629個(gè)mQTL，然而這其中只有57個(gè)mQTL在三個(gè)時(shí)期中

8、定位是相同的。代謝性狀的定位結(jié)果多種多樣，其中有95個(gè)代謝性狀在三個(gè)時(shí)期都能定位到mQTL但位點(diǎn)卻完全不同，表明了代謝組的遺傳調(diào)控存在非常強(qiáng)的時(shí)期特異性。結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，分析代謝物和定位的mQTL結(jié)果，篩選到33個(gè)候選基因。
　　4.代謝相關(guān)基因克隆利用體內(nèi)轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證了兩個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶(已報(bào)道的OsMaT-2和新鑒定的OsMaT-3)對(duì)黃酮類物質(zhì)m0723-L含量的調(diào)控作用，和一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶LOC_Os11g26950

9、對(duì)黃酮類物質(zhì)m0760-L含量的調(diào)控作用。比較了未知物質(zhì)m0434-L(m/z427/397)在RIL群體和自然群體中的結(jié)果，兩者的定位結(jié)果非常接近，而且都非常顯著;對(duì)其候選基因LOC_Os03g25500在種質(zhì)資源中進(jìn)行了比較測(cè)序和代謝檢測(cè)，揭示了一個(gè)功能性的SNP位點(diǎn)（該位點(diǎn)在MH63中編碼谷氨酸，而在ZS97中為終止密碼），但該未知物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析和候選基因的功能驗(yàn)證還有待于深入研究。代謝物m0447-L的一個(gè)微效mQTL在自然群體