乙肝肝癌診斷和預(yù)后相關(guān)的DNA甲基化譜研究.pdf

1、肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是第三位最常見的致死腫瘤。在亞洲，尤其是東亞，是肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌的病因復(fù)雜，其中大多數(shù)是由于肝炎病毒的感染，主要是HBV病毒和HCV病毒。在中國(guó)的肝癌患者，大多由于長(zhǎng)期的HBV病毒感染，造成慢性肝炎肝硬化后，最終發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌。
　　 目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚，對(duì)肝癌的診斷，治療和預(yù)后的判斷主要還是依賴臨床的病理資料和放射學(xué)的檢查。但是放射學(xué)的檢查主要受限于小肝癌和早期肝癌的分

2、辨，而擁有相同的病理資料的患者，肝癌的發(fā)展也相差較大。另外肝癌目前診斷通常過(guò)晚，即使通過(guò)肝切，肝移植手術(shù)，依然存在著高復(fù)發(fā)，高轉(zhuǎn)移率的風(fēng)險(xiǎn)，因此通過(guò)找到合適的生物分子標(biāo)志，對(duì)患者進(jìn)行合理的診斷和預(yù)后的判斷有重要的意義。
　　 DNA異常的甲基化作為一個(gè)重要表觀遺傳學(xué)的改變，被認(rèn)為是一項(xiàng)重要的腫瘤發(fā)病機(jī)制。在腫瘤中表現(xiàn)出整體水平的低甲基化和某些局部區(qū)域的高甲基化。在之前的肝癌研究中，GSTP1，RASSF1A，RIZ1，APC，S

3、OCS1和E-cadherin等啟動(dòng)子區(qū)域等都發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)出異常的高甲基化。隨著全基因掃描技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的整體甲基化譜逐漸變得清晰。之前的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)一系列潛在的肝癌生物標(biāo)記，但是報(bào)道之間能重疊的基因卻很少，這除了芯片平臺(tái)本身存在的差異，也發(fā)現(xiàn)不同的病原學(xué)背景，病理生理過(guò)程和組織學(xué)特征的肝癌有著不同的整體甲基化譜。
　　 在本次研究中，我們只篩選研究乙肝肝硬化肝癌。在第一部分中將通過(guò)全基因的甲基化芯片對(duì)肝癌、癌旁和正常肝組織進(jìn)行掃

4、描，探索可以作為潛在的肝癌診斷的生物標(biāo)記。第二部分，對(duì)比不同預(yù)后的肝癌標(biāo)本的整體甲基化譜，探索可以作為潛在的判斷肝癌預(yù)后的基因。
　　 第一部分純化的單個(gè)乙肝肝癌細(xì)胞的全基因甲基化譜
　　 目的：
　　 之前的研究主要都集中在肝組織的甲基化譜中，肝組織的復(fù)雜組成可能會(huì)對(duì)肝癌真實(shí)的甲基化狀態(tài)產(chǎn)生影響。本研究的目的通過(guò)分離純化乙肝肝癌細(xì)胞，來(lái)建立乙肝肝癌的整體甲基化譜，探索乙肝肝癌的發(fā)生機(jī)制，尋找潛在可作為乙肝肝癌診

5、斷的生物標(biāo)記。
　　 方法和結(jié)果：
　　 純化分離的單個(gè)肝細(xì)胞來(lái)自乙肝肝癌，通過(guò)IlluminaInfiniumHumanMethylation27BeadChips建立整體的甲基化譜。并通過(guò)結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析法及亞硫酸氫鹽測(cè)序，對(duì)20個(gè)在肝癌中顯著高甲基化的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)乙肝肝癌的肝細(xì)胞有獨(dú)特的全基因甲基化譜。無(wú)監(jiān)督的聚類分析顯示甲基化譜可以被分為三組：肝癌的肝細(xì)胞組，癌

6、旁的肝細(xì)胞組和正常的肝細(xì)胞組。異常甲基化基因主要富集在間隙連接、鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞通訊等信號(hào)通路中。在肝癌肝細(xì)胞組的20個(gè)最顯著高甲基化的基因中，7個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因(WNK2，EMILIN2，TLX3，TM6SF1，TRIM58，HIST1H4F和GRASP)均被證實(shí)在肝癌中出現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)的DNA高甲基化，而在配對(duì)的癌旁中則DNA低甲基化，這些發(fā)現(xiàn)在之前肝組織的標(biāo)本中還沒有被報(bào)道。
　　

7、 結(jié)論：
　　 乙肝肝癌的肝細(xì)胞存在著特異的甲基化譜可與癌旁和正常肝細(xì)胞相區(qū)別，異常甲基化基因主要富集的信號(hào)通路和細(xì)胞永生抑制凋亡相關(guān)。同時(shí)新發(fā)現(xiàn)七個(gè)基因(WNK2，EMILIN2，TLX3，TM6SF1，TRIM58，HIST1H4F和GRASP)啟動(dòng)子的高甲基化可作為潛在的乙肝肝癌診斷的生物標(biāo)記。
　　 第二部分乙肝肝癌肝移植術(shù)后與預(yù)后相關(guān)的甲基化譜研究
　　 目的：
　　 由于肝癌的高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移率

8、，肝移植術(shù)后患者的預(yù)后依然欠佳。目前尚缺少早期復(fù)發(fā)肝癌整體甲基化譜的研究，也缺少能準(zhǔn)確判斷肝癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記以篩選出高危病例，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。本實(shí)驗(yàn)的目的就是要建立乙肝肝癌早期復(fù)發(fā)病例的整體甲基化譜，篩選出與乙肝肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的異常甲基化的基因，并評(píng)估其在肝移植術(shù)后乙肝肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值。
　　 方法和結(jié)果：
　　 應(yīng)用illuminaInfinium27kHumanDNAmethylationBeadChip對(duì)兩

9、組各三例肝移植術(shù)后不同預(yù)后的乙肝肝癌組織進(jìn)行全基因組的甲基化基因掃描，同時(shí)以配對(duì)的癌旁和正常肝組織作為對(duì)照。用隨機(jī)方差模型找到四組1164個(gè)差異甲基化位點(diǎn)，用差異甲基化基因表達(dá)趨勢(shì)分析，篩選出300個(gè)與乙肝肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因(P<0.05)。通過(guò)對(duì)特異基因進(jìn)行疾病差異顯著性功能分析、信號(hào)通路分析和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析，我們挑選了16個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過(guò)臨床樣本中這些基因的表達(dá)量和啟動(dòng)子甲基化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)HIST1H2BH、SOCS2的啟動(dòng)子