抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的兩種新型單體天然藥物的分子靶點研究.pdf

1、第一部分藤黃酸通過使活性氧自由基(ROS)積聚而介導(dǎo)RPMI-8226骨髓瘤細胞caspase-3激活及SIRT1下調(diào)
　　目的:本實驗以人骨髓瘤RPMI-8226細胞為研究對象,觀察藤黃酸對RPMI-8226細胞增殖、凋亡的影響,并進一步探討分子機制。
　　方法:用噻唑藍(MTT)法檢測藤黃酸對RPMI-8226細胞增殖的影響;Hoechst33258染色法及AnnexinV-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測經(jīng)藤黃酸處理后RP

2、MI-8226細胞核形態(tài)及凋亡率的變化;DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS的積聚;Western-blot法檢測caspase-3、PARP的斷裂及SIRT1的表達。
　　結(jié)果:體外實驗中,藤黃酸能以劑量依賴方式顯著抑制RPMI-8226細胞的增殖;能明顯誘導(dǎo)RPMI-8226細胞凋亡,與caspase-3激活及PARP的斷裂有關(guān);能下調(diào)SIRT1的表達;能使RPMI-8226細胞ROS積聚,ROS清除劑NAC能減弱藤黃酸介導(dǎo)的ROS

3、積聚,阻斷藤黃酸誘導(dǎo)RPMI-8226細胞凋亡的作用,并能抑制藤黃酸下調(diào)SIRT1的作用。
　　結(jié)論:藤黃酸通過使RPMI-8226細胞ROS積聚而激活caspase-3,從而介導(dǎo)細胞凋亡;此外,ROS的聚集還導(dǎo)致了SIRT1的下調(diào)。而ROS清除劑NAC能通過抑制ROS的積聚而阻斷藤黃酸誘導(dǎo)RPMI-8226細胞凋亡及SIRT1的下調(diào)。
　　第二部分白樺脂酸抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞自噬通量和誘導(dǎo)凋亡
　　目的:研究白樺脂酸

4、對多發(fā)性骨髓瘤KM3細胞凋亡及自噬的影響,并探討它們之間相互關(guān)系。
　　方法:MTT法研究白樺脂酸對多發(fā)性骨髓瘤KM3細胞增殖的影響。AnnexinV-FITC/PI流式細胞學及Hoechst33258染色法檢測白樺脂酸對KM3細胞凋亡的影響;利用Western-blot法檢測caspase-3,PARP,Beclin1,LC3-II,和P62蛋白的變化。
　　結(jié)果:白樺脂酸能明顯抑制KM3細胞的增殖,呈時間和劑量依賴性。對

5、KM3細胞12,24和36h的IC50值分別為22.29,17.36,和13.06μg/mL。雖然caspase-3的激活參與了KM3細胞凋亡過程,但caspase-3特異抑制劑Z-DEVD-FMK不僅不能降低,反而協(xié)同了白樺脂酸對KM3細胞的凋亡誘導(dǎo)作用,提示除了caspase-3的激活,還有其他途徑參與了白樺脂酸誘導(dǎo)KM3細胞的凋亡過程。白樺脂酸能以劑量依賴的方式增加KM3細胞中LC3-II和P62的積聚,提示其能夠阻斷KM3細胞自

6、噬通量。白樺脂酸還能以劑量依賴方式下調(diào)自噬調(diào)節(jié)蛋白beclin1。當白樺脂酸與Z-DEVD-FMK合用,Z-DEVD-FMK能夠誘導(dǎo)KM3細胞自噬從而增加了LC3-II的量,這可能與Z-DEVD-FMK能減緩白樺脂酸對Beclin1的下調(diào)作用有關(guān)。與此相似,當自噬誘導(dǎo)劑rapamycin與白樺脂酸合用時,不僅能增加KM3細胞中LC3-II的積聚,同時還能增強KM3細胞對白樺脂酸誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
　　結(jié)論:白樺脂酸能誘導(dǎo)骨髓瘤KM