青蒿琥酯干預(yù)TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中的表達.pdf

1、目的：類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthriris,RA)是一種以致殘性多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病,本病以慢性、對稱性、破壞性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn),其中靶關(guān)節(jié)為近端指間關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)和掌指關(guān)節(jié),其他如顳關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、踝和足關(guān)節(jié)也常常受累。RA患者還可出現(xiàn)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)如發(fā)熱、貧血、皮下結(jié)節(jié)、血管炎,肺間質(zhì)病變等。RA主要病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥,初期滑膜充血、水腫、增厚,血管翳形成,軟骨和軟骨下骨破壞,其破壞是類似于腫

2、瘤性的破壞,是高度致殘性疾病,其中新生血管形成與細胞外基質(zhì)降解是骨侵蝕破壞過程中兩個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。減少炎性因子的釋放及抑制血管翳形成從而減緩骨侵蝕為治療的靶位,臨床上使用腫瘤壞死因子-α拮抗劑聯(lián)合慢作用抗風濕藥來治療以預(yù)防、延緩骨質(zhì)破壞從而達到阻止骨質(zhì)破壞。但腫瘤壞死因子-α拮抗劑價格昂貴,疾病的治療成本高,故迫切需要一個既能防止骨破壞的發(fā)生且能適合我國國情、為廣大患者能負擔得起并具有我國知識產(chǎn)權(quán)的藥物。本實驗旨在研究青蒿琥酯能否替代

3、腫瘤壞死因子-α拮抗劑成為廣大RA患者能用得起的抗風濕藥物,減少患者的致殘率、提高患者的生活質(zhì)量,減輕患者的經(jīng)濟負擔。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物。青蒿素具有廣泛的生物學(xué)作用:如抑制細胞增殖、抗血管增生、誘導(dǎo)細胞凋亡、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)有大量的實驗證實青蒿琥酯為一種低毒、高效的潛在免疫抑制劑[1],并且研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號途徑抑制LPS誘導(dǎo)的RA滑膜細胞分泌TNF-α[2],從而發(fā)揮抑制RA滑膜炎癥的

4、作用[3],同時還可通過抑制IL-17、TNF-α分泌及其兩者的協(xié)同性而抑制RA滑膜細胞分泌炎癥因子,從而減少血管翳的形成及對軟骨及骨的侵蝕[45]。
　　TRAF6屬于TOLL/IL-R家族,通過調(diào)控B淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路,影響細胞的生存、分化、增殖和死亡,參與調(diào)控多個生物學(xué)過程以對機體的免疫功能進行調(diào)節(jié)。抑制TRAF6的表達則可抑制炎性因子的產(chǎn)生,可視為RA治療的上游靶點。本實驗研究青蒿琥酯對TRAF6的表達影響,明確青蒿琥酯

5、確切的作用靶位,進一步探討其機制,從而為今后應(yīng)用青蒿琥酯治療RA提供實驗依據(jù)。
　　本研究通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的大鼠動物模型[6],觀察不同劑量青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中的表達,探討青蒿琥酯對TRAF6相關(guān)信號通路活化的調(diào)控作用;同時將大鼠的滑膜細胞進行原代培養(yǎng),予不同劑量的青蒿琥酯干預(yù)滑膜細胞,通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中的基因表達,用w

6、esternblotting檢測方法來檢測TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細胞中蛋白的表達,旨在為應(yīng)用青蒿琥酯治療RA提供實驗依據(jù)。
　　方法：建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)(collageninducedarthritis,CIA)的雄性Wistar大鼠模型[7],隨機分為正常對照組、CIA模型對照組、5mg/kg/d青蒿琥酯組、10mg/kg/d青蒿琥酯組、20mg/kg/d青蒿琥酯組、甲氨蝶吟(MTX)組、硫酸羥氯喹組、甲基潑尼松龍組。

7、進行21w體內(nèi)實驗,初次免疫后3w開始給藥。治療過程中連續(xù)對大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度進行評分,測量右后肢的踝關(guān)節(jié)腫脹度。治療21w后將全部動物處死取材,進行滑膜細胞原代培養(yǎng),在體外細胞培養(yǎng)穩(wěn)定后,分別加入不同劑量的青蒿琥酯,通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中的基因表達,用westernblotting檢測方法來檢測TRAF6在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細胞中蛋白的表達,同時取活體人的類風濕關(guān)節(jié)炎

8、病人的滑膜組織進行原代培養(yǎng),作對比實驗。
　　結(jié)果：
　　1.CIA大鼠造模成功率達93.3％(56/61)。
　　2.關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI):各治療組AI均較模型組有明顯改善,20mg/kg/d青蒿琥酯組優(yōu)于5mg/kg/d青蒿琥酯組、10mg/kg/d青蒿琥酯組、MTX組、羥氯喹組(P<0.05),踝關(guān)節(jié)腫脹度改善程度最明顯(P<0.05)。20mg/kg/d青蒿琥酯組與甲基潑尼松龍組(P>0.5)無統(tǒng)計學(xué)意義。

9、>　　3.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細胞中基因的表達。
　　(1)選擇人和鼠的第五代生長良好的滑膜細胞,用不同劑量的青蒿琥酯進行干預(yù),各治療組TRAF6表達下降,細胞因子分泌減少,成纖維樣滑膜細胞減少,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在各治療組TRAF6表達較CIA模型組下降,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。20mg/kg/d青蒿琥酯組TRAF6表達低于5mg/kg/d青蒿琥酯、

10、10mg/kg/d青蒿琥酯、MTX、硫酸羥氯喹及甲基潑尼松龍組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細胞中蛋白的表達
　　(1)選擇人和鼠的第五代生長良好的滑膜細胞進行干預(yù),各治療組TRAF6表達下降,炎癥因子分泌減少,增生的滑膜細胞減少,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在各治療組TRAF6表達較CIA模型組下降,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

11、5)。20mg/kg/d青蒿琥酯組TRAF6水平低于5mg/kg/d青蒿琥酯、10mg/kg/d青蒿琥酯、MTX、羥氯喹及甲基潑尼松龍組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)滑膜細胞中的表達下降。
　　結(jié)論：
　　1.在CIA大鼠模型中:關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6分以上;關(guān)節(jié)腫脹度,骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)間隙狹窄均較其它治療組嚴重。
　　2.5mg/kg/d青蒿琥酯、10mg/

12、kg/d青蒿琥酯滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕有所減輕;尤其以20mg/kg/d青蒿琥酯組關(guān)節(jié)腫脹度、滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善,體重未減輕,鉬鈀檢測未見骨質(zhì)疏松。青蒿琥酯通過調(diào)控B淋巴細胞抑制TNF-a分泌及其兩者的協(xié)同性來下調(diào)TRAF6的表達,抑制RA滑膜細胞分泌炎癥因子,從而減少血管翳的形成及對軟骨及骨的侵蝕。
　　3.MTX組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制TNF-a分泌,滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善。但是容

13、易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,體重減輕。
　　4.羥氯喹組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度等方面的作用較弱,它可以抑制TNF-a分泌,抑制炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮治療RA的作用。
　　5.甲基潑尼松龍組在改善關(guān)節(jié)炎指數(shù),踝關(guān)節(jié)腫脹度,抑制TNF-a分泌,滑膜炎癥、軟骨及骨組織侵蝕明顯改善。但是更容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。
　　6.青蒿琥酯干預(yù)下TRAF6在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)人及鼠的滑膜細胞中的表達隨著劑量的加大而明顯下降。
　　7.青蒿琥酯