聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)對大鼠移植胰島的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病是一種普遍的復(fù)雜代謝性疾病，WHO最近公布的數(shù)據(jù)表明：在全球成人人口中估計(jì)有171，000，000例糖尿病病人的發(fā)病率，到2025年將達(dá)到3億人，糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病。它可導(dǎo)致嚴(yán)重的長期的微血管及大血管并發(fā)癥，并由此帶來較高的致病率與死亡率。我國人口患病率已接近5％，與發(fā)達(dá)國家類似。盡管在世界范圍內(nèi)糖尿病人口中，1型糖尿病的比例只占到1096，但其因持續(xù)增長的發(fā)病率(歐洲

2、高達(dá)41/100，000人口/年、北美高達(dá)25/100，000人口/年)而成為主要的全球性健康問題。
　　 1型糖尿病是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致β細(xì)胞破壞及胰島素分泌的減少。其特征表現(xiàn)為抗胰島細(xì)胞抗體的出現(xiàn)(目前診斷1型糖尿病的最佳標(biāo)準(zhǔn))、嚴(yán)重的胰島素缺乏及表明胰腺β細(xì)胞被自身免疫破壞的證據(jù)。1型糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為嚴(yán)格控制的建立在嚴(yán)密血糖檢測基礎(chǔ)上的各種胰島素注射治療。但是皮下注射不能準(zhǔn)確模仿正常胰島

3、素分泌的生理過程，所以在治療過程中還需要嚴(yán)格的飲食控制，同時(shí)也增加了并發(fā)嚴(yán)重低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 當(dāng)前，達(dá)到并維持正常血糖，同時(shí)避免低血糖風(fēng)險(xiǎn)的唯一途徑，就是胰島替代治療：胰腺移植及胰島移植。β細(xì)胞替代療法在經(jīng)過選擇的1型糖尿病人中，已經(jīng)部分的成功逆轉(zhuǎn)了腎及神經(jīng)系統(tǒng)的長期并發(fā)癥。在最近的20余年，胰腺移植治療1型糖尿病取得了較好的效果。同時(shí)，關(guān)于胰島移植的研究已經(jīng)取得了顯著的成果。首先，人胰島移植治療糖尿病已有成功的報(bào)道：Sha

4、piro等報(bào)道了接受胰島移植的36例病人中，有21例(58％)在隨后的1年里脫離了胰島素治療，其中有5例病人徹底脫離胰島素治療的時(shí)間維持了2年。Ryan等在65例接受了胰島移植病例的5年研究中，報(bào)道了脫離胰島素依賴的中位時(shí)間為15個(gè)月。實(shí)際上，有大約10％的病例保持了長期的脫離胰島素依賴狀態(tài)；第二，胰腺保存技術(shù)的改進(jìn)、胰島分離率的提高以及合理的免疫抑制劑方案和抗炎治療的應(yīng)用，使胰島移植取得了同胰腺移植相近的效果；第三，實(shí)驗(yàn)表明，干細(xì)胞分

5、化的胰島細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病，這預(yù)示著胰島移植有著潛在無限的組織來源。
　　 胰島細(xì)胞移植已被證實(shí)可以有效降低血糖，使糖尿病患者由胰島素依賴型轉(zhuǎn)為非依賴性，或減少胰島素的用量，并可在很大程度上改善患者依靠胰島素治療時(shí)不能防止的糖尿病慢性并發(fā)癥；此外胰島細(xì)胞移植還具有安全、基本無創(chuàng)傷性、并發(fā)癥少及易重復(fù)多次移植的特點(diǎn)。胰島移植被認(rèn)為是徹底治愈1型糖尿病并阻止其并發(fā)癥進(jìn)展的最終方案。
　　 胰島的移植量至少要達(dá)到全胰的10％～

6、20％才能維持正常血糖和糖基化血紅蛋白水平。胰腺胰島的數(shù)量僅占胰腺細(xì)胞總數(shù)的2％，并且很難從大塊的胰腺外分泌腺體組織中分離及純化。由于胰島分離純化過程中的損傷，分離時(shí)間較長，以及移植后短時(shí)間內(nèi)沒有血供建立，造成了胰島凋亡和死亡。一般需2到4個(gè)供體的胰島才能使患者完全脫離胰島素，胰島移植登記合作機(jī)構(gòu)在2006年度報(bào)告中，報(bào)道了自1999年到2005年期間，共進(jìn)行了225例胰島移植。約2/3的受體1年內(nèi)脫離了胰島素依賴(定義為至少14天不需

7、胰島素干預(yù)治療)，而在第2年該比例下降到1/3。
　　 1型糖尿病未來的主要治療目標(biāo)是促進(jìn)β細(xì)胞的再生，可以由β細(xì)胞的自我復(fù)制或利用干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行祖細(xì)胞的定向分化從而逃避自身免疫并促進(jìn)內(nèi)源性胰島素的分泌來實(shí)現(xiàn)。
　　 目前國內(nèi)外學(xué)者正積極進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究：①改進(jìn)胰島的分離技術(shù)，以獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的胰島。②研究對胰島沒有毒性的免疫抑制方案。③利用干細(xì)胞技術(shù)和異種移植來克服胰島來源短缺。如能延長胰島體外培養(yǎng)時(shí)間并使

8、其保持良好的功能，將能大大減少移植所需的胰島用量，從而突破胰島移植數(shù)量受限的的瓶頸，使糖尿病的治療獲得新的發(fā)展。
　　 由于間充質(zhì)干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)免疫耐受，并且在體外具有向胰島素分泌細(xì)胞定向分化的潛力，上述特性可以達(dá)到1型糖尿病的主要治療目標(biāo)，所以其作為1型糖尿病一種治療選擇的代表而引起人們的關(guān)注。
　　 MSC最早是從骨髓分離出的成體干細(xì)胞。1976年Friedenstein發(fā)現(xiàn)骨髓單核細(xì)胞在塑料培養(yǎng)皿中形成的貼壁細(xì)胞易

9、于提取、分離及擴(kuò)增，可在一定條件下向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，并且在體外擴(kuò)增數(shù)十代后仍能保持其多向分化潛能，并且在損傷環(huán)境下還可以誘導(dǎo)擴(kuò)增，參加組織修復(fù)或者再生反應(yīng)，因此這類細(xì)胞被命名為“MSC”。MSCs能分泌多種造血及非造血生長因子、白介素和趨化因子，如M-CSF、SCF、FIT-3配基、TPO、IL-6、7、8、11、12、14、15和LIF等。這些細(xì)胞因子在造血干細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用。目前主要是根據(jù)其形態(tài)、抗

10、原表型及分化潛能來鑒定MSCs。MSCs高表達(dá)MHCⅠ類分子、SH2，SH3，CD29，CD44，CD73，CD90，CD106，CD120a，CD124，低表達(dá)MHCⅡ類分子及Fas配體，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD34，CD45，CD14，CD117和與移植免疫排斥發(fā)生密切相關(guān)的表面標(biāo)志HLA-DR，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，CD40及Fas凋亡受體等，這表明MSCs在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，預(yù)示著植入MSCs后不會

11、引起或引起極低的免疫排斥反應(yīng)。
　　 本課題的第一部分是利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合提取、純化4周齡Wistar大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)傳代，得到數(shù)量、活性、純度高而較均一的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度，為下一步聯(lián)合培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。
　　 MSCs能夠誘導(dǎo)免疫耐受。有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有組織同源性，聯(lián)合胰島移植時(shí)，其可以抑制T細(xì)胞激活，從而使受體與移植胰島形成微嵌合狀態(tài)，使移植術(shù)后不用長期服

12、用抗排斥藥物，達(dá)到移植胰島的長期存活。
　　 胰島的死亡，包括分離和培養(yǎng)過程中β-細(xì)胞的丟失，仍然是成功胰島移植中的重大障礙。胰島細(xì)胞死亡(包括細(xì)胞凋亡和β-細(xì)胞失活)的主要原因是因?yàn)橐葝u分離純化及培養(yǎng)過程中移植胰島缺氧及營養(yǎng)缺失。因此為了阻止胰島的死亡和加強(qiáng)移植胰島的功能，出現(xiàn)了許多改善細(xì)胞培養(yǎng)條件的手段。
　　 近年來的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可通過分泌營養(yǎng)因子、抗炎性因子、抗凋亡因子或者通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸、融合等方式參

13、與組織器官的損傷修復(fù)，維持正常組織細(xì)胞功能。目前對于MSCs對移植胰島的潛在營養(yǎng)作用目前尚未完全清楚，盡管已有研究證實(shí)由MSCs分泌的因子如白介素-6(IL-6)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)，可以提高移植后移植胰島的質(zhì)量。但是，對間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞來產(chǎn)生營養(yǎng)作用及相關(guān)分子信號級聯(lián)傳導(dǎo)的機(jī)制仍然知之甚少。
　　 本實(shí)驗(yàn)第二部分利用間充質(zhì)干細(xì)胞與移植胰島聯(lián)合培養(yǎng)，觀察其在延長胰島體外存活時(shí)間、保護(hù)胰

14、島功能等方面的作用。為胰島移植前如何有效的保存移植胰島的功能做一定的探索。
　　 第一部分間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、純化、傳代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：
　　 建立Wistar大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、體外培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步的研究打基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合提取、純化4周齡Wistar大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)傳代擴(kuò)增，得到數(shù)量、活性、純度高而較均一的

15、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度。使用trypan blue染色鑒定其活性。
　　 結(jié)果：
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)傳代3代后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45陰性率為94％，CD90陽性率為95％，兩者熒光強(qiáng)度有顯著性差異，活性均大于95％，純度及活性均達(dá)到了進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 結(jié)論及意義
　　 利用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合來分離、培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以獲得高活性高純度的

16、MSCs，是實(shí)用、便捷和可行的方法。同時(shí)對成功培養(yǎng)過程中注意事項(xiàng)加以總結(jié)，為下一步聯(lián)合移植胰島培養(yǎng)提供種子細(xì)胞打下了基礎(chǔ)。
　　 第二部分聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)對大鼠移植胰島的保護(hù)作用的研究
　　 目的：
　　 有研究證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞除了可在特定條件下跨胚層分化為多種組織細(xì)胞外，還可通過分泌細(xì)胞因子或者通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸、融合等方式參與組織器官的損傷修復(fù)，維持正常組織細(xì)胞功能。本研究探討間充質(zhì)干細(xì)胞與移植胰島聯(lián)

17、合培養(yǎng)在延長胰島體外存活時(shí)間、保護(hù)胰島功能等方面的作用。
　　 方法：
　　 使用Histopaque-1077一步法，建立密度梯度來分離純化Wistar大鼠胰島，并對提取胰島的數(shù)量和活性進(jìn)行評估；25只Wistar大鼠每只老鼠提取直徑在50μm以上的胰島按隨機(jī)對照表法將胰島培養(yǎng)分單純胰島基礎(chǔ)培養(yǎng)、單純胰島高糖培養(yǎng)、胰島與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合基礎(chǔ)培養(yǎng)、胰島與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合高糖培養(yǎng)四組，每組又分3小組(3d組、7d組、14d

18、組)，15孔/組；觀察胰島形態(tài)變化及胰島存活率，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測胰島素分泌量及刺激指數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 聯(lián)合培養(yǎng)組3d、7d、14d的胰島存活率均顯著高于單純培養(yǎng)組，P<0.01；高糖刺激下聯(lián)合培養(yǎng)組7d的胰島素分泌量及刺激指數(shù)均高于單純培養(yǎng)組，P<0.01。
　　 結(jié)論：
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島聯(lián)合培養(yǎng)可以明顯延長胰島體外存活時(shí)間并保持其活性，對胰島具有良好的保護(hù)作用。