表達(dá)EGFR與HER2雙特異性抗體融合蛋白腺病毒基因治療系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的與意義：表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)在許多腫瘤細(xì)胞中異常過(guò)量表達(dá)，與腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，是腫瘤靶向治療的重要靶點(diǎn)。西妥昔單抗(cetuximab)是EGFR的全長(zhǎng)單克隆抗體，是許多類(lèi)型惡性腫瘤臨床治療的一線藥物。然而，應(yīng)用西妥昔單抗治療費(fèi)用昂貴，且單用其治療對(duì)一些重要腫瘤，包括肝癌的療效不佳。HER2是EGFR家族的一員，雖然只在少數(shù)腫瘤中過(guò)量表達(dá)，在大多數(shù)腫瘤中低量

2、表達(dá)，但其在整個(gè)EGFR家族信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置，是單用西妥昔單抗對(duì)一些重要腫瘤療效不佳的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，HER2轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體編碼的蛋白—Herstatin是HER2的天然抑制物，能與HER2及EGFR高親和性特異結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及其抗凋亡效應(yīng)，其C末端的79個(gè)氨基酸（HERIN）在結(jié)合HER2與EGFR的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　因而，本研究將EGFR單克隆抗體cetuximab與HerstatinC末端79個(gè)氨基酸融

3、合，并利用復(fù)制缺陷型腺病毒來(lái)攜帶該融合蛋白基因，建立表達(dá)EGFR和HER2雙特異性抗體的腺病毒治療系統(tǒng)，作用于EGFR與HER2兩個(gè)靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞EGFR通路的同時(shí)，抑制EGFR家族成員間形成異源二聚體，增強(qiáng)cetuximab對(duì)EGFR和HER2雙陽(yáng)性，以及EGFR陽(yáng)性、HER2弱陽(yáng)性腫瘤的治療效果。與此同時(shí)，應(yīng)用全長(zhǎng)抗體基因治療這一新系統(tǒng)，將大幅降低cetuximab治療的費(fèi)用，有望建立一套新型高效的惡性腫瘤治療方法。
　　

4、研究方法：通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，比較不同SV40poly（A）信號(hào)序列對(duì)上游基因的表達(dá)量的調(diào)控作用，篩選建立高效的全長(zhǎng)抗體表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)合拉PCR，將抗體cetuximab基因與編碼HerstatinC末端79個(gè)氨基酸（Herin）的序列融合，構(gòu)建攜帶西妥昔單抗全長(zhǎng)基因與Herin融合基因的腺病毒穿梭載體pDC339-AT2-Herin，并在293細(xì)胞內(nèi)包裝成重組病毒Ad5-AT2-Herin。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)A

5、d5-AT2-Herin表達(dá)全長(zhǎng)抗體融合蛋白的體外表達(dá)量；應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)所表達(dá)全長(zhǎng)抗體輕重鏈的完整性及均衡性；應(yīng)用間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)所表達(dá)的融合蛋白與EGFR(+)Her2(-)的A431細(xì)胞，以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3細(xì)胞膜結(jié)合的特異性。
　　研究結(jié)果：在不同細(xì)胞中poly（A）信號(hào)序列對(duì)上游基因的調(diào)控作用存在差異，如293細(xì)胞中正反向SV40poly（A）信號(hào)對(duì)上游基因的調(diào)控?zé)o差異

6、，L-02、Hela細(xì)胞中正反向SV40poly（A）信號(hào)對(duì)上游基因的調(diào)控作用差異顯著，且正向SV40poly（A）序列優(yōu)于SV40poly（A）序列；ELISA檢測(cè)分析表明：Ad5-AT2-Herin在293細(xì)胞中的表達(dá)量為209.3ng／ml～317.3ng／ml；Westernblot顯示輕重鏈表達(dá)平衡，大小符合預(yù)期；間接免疫熒光顯示腺病毒表達(dá)的融合蛋白與A431細(xì)胞表面受體EGFR及SK-OV-3細(xì)胞表面受體Her2均能特異性結(jié)