HER2特異性抗體靶向納米顆粒的制備及抗腫瘤機制研究.pdf

1、第一部分Anti-HER2 Fab’修飾的包裹PE38KDEL的PLGA靶向納米顆粒(PE-NP-HER)的制備和表征 1、PE38KDEL毒素和Anti-HER2 Fab’制備利用原核系統(tǒng)表達和鎳柱親和層析純化得到了純度超過95％的PE38KDEL，rhuMAbHER2經(jīng)過木瓜蛋白酶酶切后得到了了純度超過95％的Anti-HER2 Fab’片段。 2、PE38KDEL毒素的生物活性由于PLGA納米顆粒的制備過程包括有機

2、溶劑和超聲的處理，這些制備方法可能會影響PE38KDEL的完整性和活性，熒光素酶蛋白體外翻譯實驗結果證實PE38KDEL的活性在經(jīng)過PLGA包裹以后得到絕大部分保留。 3、納米表征通過復乳溶劑揮發(fā)法制備得到了包裹PE38KDEL的PLGA納米顆粒(PE-NP)，然后利用碳化二亞胺法將Anti-HER2 Fab'連接在PE-NP-表面制備得到了PE-NP-HER靶向納米顆粒。結果顯示：PE-NP和PE-NP-HER的平均粒徑分別為

3、108.3±13.9 nm和124.2±21.2 nm(mean±SD；n=10)，透射電鏡證實納米顆粒外形圓整，大小均一，PE-NP的包裹效率為41.9±2.3％(mean±SD，n=4)，載藥量為8.5±0.2μg/mg(mean±SD，n=4)，PE-NP-HER的抗體連接效率為19.4±2.4μg/mg(mean±SD，n=4)，PE-NP和PE-NP-HER的zeta電位分別為-36±5 mV and12±7mV(mean±S

4、D；n=10)。 4、體外釋放實驗PE-NP的體外釋放具有規(guī)律性，初期有16.6％的突釋，24 h累計釋放量達28.3％，在96h達到50％。 第二部分靶向納米顆粒的體內(nèi)外抗腫瘤活性 1、靶向納米顆粒的競爭抑制試驗PE-NP-HER和PE-HER(PE38KDEL和rhuMAbHER2的化學偶聯(lián)物)均能競爭rhuMAbHER2與高表達HER2的D2F2/E2細胞的結合，而且PE-NP-HER的競爭能力較PE-HE

5、R強。 2、靶向納米顆粒的內(nèi)吞共聚焦顯微鏡證實PE-NP-HER能特異性結合D2F2/E2細胞并被其內(nèi)吞，而非靶向的PE-NP或PE-NP-anti-CD25和D2F2/E2細胞的結合和內(nèi)吞很弱。 3、靶向納米顆粒的體外細胞毒性體外細胞殺傷實驗證實PE-NP-HER對高表達HER2的乳腺癌細胞株具有特異性的殺傷活性，而HER2表達陰性的乳腺癌細胞株的殺傷活性較弱。 4、靶向納米顆粒的半數(shù)致死劑量LD50和肝毒性對

6、小鼠來說，PE-NP-HER的LD50為6.8mg/kg，大大超過PE-HER和PE38KDEL的LD50(2.2mg/kg)。對小鼠靜脈注射PE-HER和PE38KDEL后，ALT(反應肝臟損傷的指標)和注射之前比有急劇的上升，然而在注射PE-NP-HER納米顆粒后，ALT變化不大。 5、靶向納米顆粒的免疫原性和體外避免中和性抗體中和的研究和PE38KDEL和PE-HER相比，PE-NP和PE-NP-HER的免疫原性大大減小。

7、體外避免中和性抗體中和的研究證實PE-NP-HER的細胞毒作用不受抗PE38KDEL中和性抗體的影響。 6、靶向納米顆粒的的體內(nèi)抗腫瘤活性小鼠體內(nèi)抗腫瘤實驗證實PE-HER和PE-NP-HER均以劑量依賴性的方式抑制了腫瘤生長，并且PE-NP-HER的抗腫瘤活性優(yōu)于PE-HER和其他對照組。 7、靶向納米顆粒的在預免疫小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性在預免疫PE38KDEL和PE-NP的小鼠中進行了相似的抗腫瘤實驗。在抗PE38KD

8、EL中和性抗體存在的情況下，PE-NP-HER仍然顯示出良好的抗腫瘤活性，而PE-HER的抗腫瘤活性大大下降。 第三部分 Anti-HER2 Fab'修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質體(PE-HER-liposomes)的制備和表征 1、納米表征PE-HER-Liposomes的平均粒徑為194.47±3.2 nm，包封率為90.49±6.39％，載藥量為10.17±1.39μg/mg，連接在PE-HER-L

9、iposomes上的Anti-HER2 Fab’的量為27.83±3.13μg/mg磷脂，抗體的連接效率為66.94±4.43％(mean±SD；n=3)。 2、脂質體的體外釋放實驗普通脂質體的PE38KDEL的釋放速率遠大于PEG化脂質體的釋放速率，表明PEG化的脂質體顯示出較慢釋放速率并能滿足作為有效藥物傳遞系統(tǒng)的需要。 第四部分免疫脂質體的體外抗腫瘤活性研究 1、體外細胞結合活性流式細胞術證實PE-HER-

10、liposomes能特異性靶向HER2高表達的SK-BR3細胞。共聚焦顯微鏡結果顯示PE-HER-liposomes能明顯被SK-BR3細胞特異性內(nèi)吞。 2、體外細胞毒性PE-HER-liposomes對HER2高表達的SK-BR3細胞的毒性最大，對HER2中度表達的MDA-MB-231細胞的毒性次之，而對HER2表達陰性的MCF-7細胞的毒性最小。PE-HER-liposomes對SK-BR3細胞的細胞毒性較PE-HER大，在

11、MDA-MB-231細胞中也得到了相似的結論。 第五部分介導基因轉運的DC-chol/DOPE陽離子脂質體的制備與表征 1、陽離子脂質體/pDNA復合物粒徑和zeta電位的測定DC-chol/DOPE脂質體在復合質粒DNA(pDNA)后，粒徑的變化呈先遞增后減小的趨勢。隨著脂質體中PEG含量的增加，脂質體粒徑變化幅度越來越小。對于不同DC-chol/DOPE摩爾比的脂質體而言，DC-chol含量越高的脂質體的zeta電位

12、越高，PEG含量越高的脂質體的zeta電位變化幅度越小，和0mV越接近。 2、陽離子脂質體/siRNA復合物粒徑和zeta電位的測定DC-chol/DOPE脂質體在復合siRNA后，粒徑、zeta電位的變化趨勢和陽離子脂質體/pDNA變化趨勢一致。 3、凝膠阻滯實驗當DC-chol/pDNA的質量比≥2：1時，pDNA完全被凝膠阻滯住。對于DC-chol含量較低的脂質體來講，當DC-chol/siRNA的質量比為7.5，

13、10，15時，脂質體能完全包裹siRNA。隨著PEG含量的增加，siRNA的包封能力大大降低。 4、超濾離心法檢測siRNA的包封率DC-chol/siRNA的質量比越大，siRNA的包封率越高。然而，PEG化對siRNA的包封率有負面影響。 5、DNasel酶切實驗當pDNA和脂質體形成脂質體/pDNA復合物后，DNaseI對pDNA的降解作用減弱，PEG含量越高的DC-chol/DOPE脂質體對pDNA的保護作用越弱

14、。 6、siRNA的血清穩(wěn)定性實驗DC-chol/DOPE脂質體能顯著增加siRNA的血清穩(wěn)定性。 7、pDNA轉染當DC-chol/DOPE的摩爾比為1/2時，脂質體的轉染效率最高。當DC-chol/pDNA的質量比為3/1時，轉染效率最高。隨著DC-chol/pDNA的質量比逐漸增加，pDNA轉染效率逐漸遞減。PEG化能顯著降低脂質體的轉染效率。 8、siRNA轉染在DC-chol/DOPE的摩爾比為1/1時

15、，脂質體的轉染效率最高。對于不同配比的DC-chol/DOPE脂質體來說，無血清轉染效率要高于有血清轉染效率。 9、siRNA轉染的基因沉默效率siRNA的基因沉默效率和siRNA的轉染效率呈正比。 第六部分 Anti-HER2 Fab'修飾的DC-chol/DOPE靶向陽離子脂質體(HER2-Flip)的制備和靶向性研究 1、HER2．Flip的體外靶向性HER2-Flip和Lip(無靶向性的DC-chol/D

16、OPE陽離子脂質體)的熒光結合強度隨著脂質體的濃度上升而上升，然而Lip的熒光結合強度顯著弱于HER2-Flip。Anti-HER2 Fab’能劑量依賴性的抑制HER2-Flip與SK-BR3細胞的結合，而對Lip和SK-BR3細胞結合沒有任何作用。 2、HER2-Flip-FAM-siRNA的體外靶向性HER2-Flip-FAM-siRNA(HER2-Flip和FAM-siRNA的復合物)的熒光結合強度隨著脂質體的濃度上升而上

17、升，然而Lip-FAM-siRNA(Lip和FAM-siRNA的復合物)的熒光結合強度顯著弱于HER2-Flip-FAM-siRNA。Anti-HER2 Fab’能劑量依賴性的抑制HER2-Flip-FAM-siRNA與SK-BR3細胞的結合，而對Lip-FAM-siRNA和SK-BR3細胞結合沒有任何作用。 3、共聚焦實驗HER2-Flip-cy3-siRNA能被SK-BR3細胞特異性的大量內(nèi)吞，而Anti-HER2 Fab’