腺病毒載體左側ITR區(qū)對下游基因表達特異性的影響.pdf

1、惡性腫瘤是當今社會威脅人類健康的主要疾病，腫瘤基因治療的迅速發(fā)展為攻克這類嚴重威脅人類生命健康的疾病帶來新的希望。基因轉運系統(tǒng)是基因治療過程中的關鍵環(huán)節(jié)，在腫瘤的基因治療研究中，腺病毒載體目前應用最多的一種病毒載體。研究表明，外源基因的高表達使得宿主細胞的免疫反應增加，從而限制了腺病毒載體的功效。所以靶向感染腫瘤細胞的重組腺病毒逐漸成為關注的熱點。靶向轉運是攻克這些問題的一種重要策略，即在靶細胞中運用腫瘤特異性啟動子有選擇地表達特異性基

2、因。然而，一些具有高特異性和選擇性表達活性的啟動子在克隆到腺病毒載體之后會被改變甚至缺失。對于這種現(xiàn)象，一種比較合理的解釋是腺病毒基因序列中，目的基因的附近存在著增強子或潛在的轉錄起始位點，它們與啟動子相互作用從而導致“非特異性”轉錄。目前報導的5型腺病毒基因組中含有增強子的元件有反向末端重復序列(inverted terminal repeats，ITR)，E2和E4啟動子，pⅨ啟動子和E1A增強子等。5型腺病毒基因組左側含有兩個增強

3、子元件，一個是重復序列，特異性調節(jié)E1A基因在細胞中的轉錄，另一個在重復序列即左側ITR之間，順式調節(jié)所有早期基因的轉錄，因此對下游基因的表達有著顯著影響。
　　 目的：構建一系列含GFP報告基因的腺病毒載體，通過其熒光表達分析來研究腺病毒載體左側ITR區(qū)對下游基因表達特異性的影響。
　　 方法：采用一系列分子生物學方法及Gateway技術重組腺病毒載體左側ITR區(qū)下游構建正反兩個方向含有人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟

4、動子、CMV啟動子及GFP報告基因的重組腺病毒載體。重組腺病毒質粒經(jīng)PacⅠ線性化后用脂質體轉染法轉染293A細胞，包裝并擴增出重組腺病毒顆粒，TCID50測得滴度后分別以相同的MOI感染不同的細胞，觀察熒光表達情況。
　　 結果：
　　 1)成功構建了hTERT、rhTERT、CMV、rCMV和rGFP五種重組腺病毒表達載體，并利用293A包裝系統(tǒng)制備了這五種高滴度的重組腺病毒。
　　 2)重組腺病毒分別感染2

5、93A細胞、人鼻咽癌細胞CNE、人骨肉瘤細胞U-2OS、人乳腺癌細胞435S、人胰腺癌細胞Panel細胞，發(fā)現(xiàn)在293A細胞和Pancl細胞腺病毒的增殖效率較高，熒光表達較強。
　　 3)將各病毒在各細胞中的熒光表達量進行分組。在各細胞中分別以CMV和rCMV為一組，hTERT和rhTERT為一組。發(fā)現(xiàn)，在各細胞中，各組總體間均有差異。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各組內熒光表達量不存在顯著差異。
　　 4)無啟動子的重組腺病毒在腺病毒