稻曲病菌T-DNA插入突變體B-726、B-1015側翼相關基因的克隆.pdf

1、通過田間致病力試驗，從稻曲病菌T-DNA插入突變體庫中篩選獲得了一株T-DNA插入致病力減弱的突變菌株B-726和一株致病力喪失突變菌株B-1015。本研究分析突變菌株B-726的生物學性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P1相比，突變菌株B-726在MM，TB3和PSA三種固體培養(yǎng)基上生長速率均下降。在液體培養(yǎng)基PS中，B-726的產(chǎn)生分生孢子的能力顯著降低。用PCR檢測傳代培養(yǎng)5代B-726基因組的T-DNA插入穩(wěn)定性，結果表明T-DNA能夠隨著

2、稻曲病菌的傳代穩(wěn)定遺傳。Southern雜交分析B-726外源基因插入為單拷貝。利用hiTAIL-PCR獲得T-DNA插入位點的側翼序列;運用RACE-PCR技術，克隆與插入位點毗鄰的基因全長，結果得到一個全長為1296 bp，該基因由2個長度分別為406bp和798 bp的外顯子和1個長度為88 bp的內含子組成。將該基因的cDNA全長序列開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)分析表明，包含1個長度為465 bp的

3、開放閱讀框（ORF），可編碼154個氨基酸，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）長度為110 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）的長度為631bp，將其命名為Uvt-726。序列分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點在Uvt-726上游344 bp處。用半定量RT-PCR分析基因表達情況，結果顯示Uvt-726基因表達量在B-726中較P1顯著下降。在已知的功能蛋白基因中，沒有比對到同源基因?？寺×?個可能與稻曲病菌致病力相關的新基因，推斷該基因在稻

4、曲病菌致病過程中起著重要的作用。
　　進一步分析稻曲病致病力喪失突變菌株B-1015的生物學性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P1相比，B-1015的生長速率明顯降低，在PS培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量也顯著降低。將T-DNA兩端側翼序列分別上傳到稻曲病菌的全基因組測序數(shù)據(jù)庫中比對，對B-1015的T-DNA插入位點側翼序列分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入可能導致了稻曲病菌的基因組發(fā)生了重排。RACE PCR分別在兩邊的側翼序列上克隆得到一個基因Uvt1015R

5、和Uvt1015L。Uvt1015R基因全長為1560 bp，中間被一個長度為60 bp的內含子隔開，兩個外顯子的長度分別為631bp和869 bp。ORF分析表明該基因包含一個長度為948bp的開放閱讀框可編碼295個氨基酸，5'-UTR長度為341 bp，3'-UTR長度為271bp。Uvt1015L基因全長556bp，不合內含子，包含一個長度為351bp的ORF，可編碼116個氨基酸，5'-UTR為31 bp，3'-UTR長度為1

6、71 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)T-DNA插入在兩個基因序列中間，RT-PCR結果顯示在突變菌株B-1015中Uvt1015R表達量下降，Uvt1015L基因都不表達。在已知的功能蛋白基因中，沒有比對到與這兩個基因同源基因。稻曲病菌突變菌株B-1015致病力等重要生物學表型發(fā)生改變，可能是由于T-DNA的插入導致了B-1015基因組重排和Uvt1015R、Uvt1015L基因結構的破壞。
　　分離T-DNA標記的功能基因是研究稻曲病菌致病

7、機制的前提，而解析功能基因在稻曲病菌致病過程中的作用需對基因進行功能驗證。將潮霉素磷酸轉移酶（HPH）基因作為篩選標記基因，構建UVT-726基因敲除盒。以農桿菌質粒PC-P1tk為載體，利用農桿菌介導轉化稻曲病菌將基因敲除盒導入到稻曲病菌。攜帶基因敲除盒的T-DNA轉化到稻曲病菌內，在毒力蛋白的幫助下T-DNA發(fā)生異源整合到稻曲病菌基因組，或者發(fā)生同源重組，實現(xiàn)目的基因替換。篩選具有潮霉素抗性的轉化子，用PCR檢測基因敲除的結果，旨在