水稻T-DNA插入突變體庫側(cè)翼序列的分離和OsBClL家族基因的功能研究.pdf

1、隨著水稻基因組測序的完成,水稻基因組學(xué)研究已經(jīng)步入功能基因組學(xué)時代。為了在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析水稻基因的功能,最直接有效的方式是構(gòu)建大量的突變?nèi)后w,然后利用正向遺傳學(xué)或反向遺傳學(xué)策略進行基因功能的研究。對于T-DNA或轉(zhuǎn)座子等插入型突變體的基因克隆,無論采用正向遺傳學(xué)方法或采用反向遺傳學(xué)方法,都必須分離插入位點的側(cè)翼序列。通過建立側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫,人們可以很容易地檢索到目的基因的突變體,從而進行基因克隆。
　　 本研究以本實

2、驗室的T-DNA插入突變體庫為材料,完成了12,432份T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性檢測工作,利用TAIL-PCR技術(shù)分離得到T-DNA插入位點側(cè)翼序列5,082條。COBRA-like蛋白在植物纖維素合成和細胞擴張中具有重要的作用,本研究采用正向遺傳學(xué)與反向遺傳學(xué)相結(jié)合的方法,研究鑒定了水稻中兩個COBRA-like基因OsBC1L4和OsBC1L5的生物學(xué)功能。本研究還克隆了一個影響水稻分蘗數(shù)的基因LTW1并進行了功能分析。

3、　　 本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.完成12,432份水稻T-DNA插入突變體庫TO代轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性檢測工作,其中10,770個家系為T-DNA插入陽性植株,T-DNA陽性率約為86.6％。
　　 2.對T-DNA插入陽性的家系分離側(cè)翼序列,共計得到T-DNA插入位點側(cè)翼序列5,082條,其中的2,644條序列與水稻基因組匹配較好(E-value<10-5),基因組定位率約為52.0％。
　　

4、 3.通過對分蘗突變表型的正向篩選,獲得2個T-DNA側(cè)翼序列和分蘗突變性狀共分離的家系04Z11EM13(OsBC1L4)和LTW1。
　　 4.對水稻OsBC1L家族成員進行了分子特征、染色體位置、系譜關(guān)系及表達分析,并通過反向遺傳學(xué)策略,搜集了5個OsBC1L基因的插入家系,發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因參與水稻花粉的發(fā)育。
　　 5.在04Z11EM13家系中,T-DNA插入到OsBC1L4基因的第4個外顯子中,造成了

5、分蘗少、矮化的突變表型。通過共分離檢測和互補實驗克隆了OsBC1L4基因。經(jīng)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)osbc1l4突變體具有不正常的細胞擴張、降低的次生壁厚度和增力的淀粉積累。通過測定纖維素和木質(zhì)素含量,發(fā)現(xiàn)osbc1l4突變體的纖維素含量下降了24％。采用RT-PCR和組織原位雜交技術(shù)分析了OsBC1L4基因的表達模式,發(fā)現(xiàn)該基因在薄壁組織和厚壁組織都有表達。通過進行OsBC1L4蛋白的亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要位于細胞壁和細胞

6、膜上。通過表達相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)OsBC1L4基因與初生壁形成相關(guān)的纖維素合成酶基因共表達。用real-time方法檢測了纖維素合成相關(guān)基因和OsBC1L基因在osbc1l4突變體與野生型中的表達量,發(fā)現(xiàn)纖維素合成相關(guān)基因的表達在osbc1l4突變體中升高了,這可能反映了纖維素合成過程中的一種反饋機制,即通過升高其它纖維素合成相關(guān)基因的表達來彌補osbc1l4突變體中的纖維素損失。
　　 6.在OsBC1L5家系中,T-DNA插入

7、到OsBC1L5基因的唯一的外顯子中。該Tos17插入家系無純合單株。通過雜合植株與野生型植株的正反雜交,發(fā)現(xiàn)osbc1l5基因型的雄配子缺陷。經(jīng)體外花粉萌發(fā)實驗,發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因可能參與水稻花粉的萌發(fā)。通過RNAi抑制實驗,發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因?qū)λ净ǚ郾诘陌l(fā)育可能也有影響。
　　 7.在LTW1家系中,T-DNA插入到LTW1基因的唯一的外顯子中,造成了分蘗少、易枯萎的突變表型。通過共分離檢測和互補實驗克隆了LTW1