稻曲病菌T-DNA插入突變體A880-1、B1015側(cè)翼相關(guān)基因的克隆及功能分析.pdf

1、本研究基于啟動(dòng)子捕獲技術(shù)，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(AtMT)構(gòu)建稻曲病菌突變體庫(kù)，獲得T-DNA插入突變體9800余株。其中A庫(kù)中突變體個(gè)數(shù)為5600余株，其野生菌株為70-22;B庫(kù)中突變體個(gè)數(shù)為4200余株，其野生菌株為P1。
　　通過(guò)熒光顯微觀察，篩選獲得T-DNA插入在稻曲病菌啟動(dòng)子下游區(qū)域的突變體10株。其中A庫(kù)6株，分別為A880、A2000、A2331、A4829、A5248和A5297;B庫(kù)4株，分別為B111、B3

2、67、B913和B4865。在這10株突變體的生長(zhǎng)速率測(cè)定試驗(yàn)中，A880的純化菌株A880-1和野生菌株70-22相比，在馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基(PSA)、TB3固體培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基（MM)中生長(zhǎng)速率均變慢;在MM培養(yǎng)基中，A880-1中出現(xiàn)畸形菌絲，且在這些菌絲末端有大量的薄壁分生孢子長(zhǎng)出，因此突變體A880-1用來(lái)做進(jìn)一步的研究。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，突變體A880-1的菌絲與孢子都能被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC

3、R)技術(shù)證實(shí)了T-DNA插入在A880-1基因組中。經(jīng)過(guò)Southern雜交分析證實(shí)了T-DNA在A880-1基因組中為單拷貝插入。運(yùn)用高效的熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(hi-TAILPCR)技術(shù)，克隆獲得了T-DNA上gfp5'端上游，A880-1基因組DNA中2038bp大小的啟動(dòng)子序列，并將該啟動(dòng)子命名為puv880。將puv880在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)存在同源性的序列。經(jīng)過(guò)分析在puv880中找到啟動(dòng)子的核心元件TATA-bo

4、x、CAAT-box以及幾個(gè)其他可能的真核生物調(diào)控元件。同時(shí)在puv880發(fā)現(xiàn)三個(gè)類似于TATA-box的結(jié)構(gòu)以及一個(gè)TATA-box的反向互補(bǔ)序列。依據(jù)5’缺失分析方法，選取puv880上靠近gfp一端長(zhǎng)度分別為444bp、650bp、864bp和1045bp長(zhǎng)的四段序列，和A880-1基因組中T-DNA一起擴(kuò)增，然后將這四個(gè)片段在PEG的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌野生菌Guy11基因組中，結(jié)果表明所有的四個(gè)片段都表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果證實(shí)了puv880的啟動(dòng)功能，同時(shí)證實(shí)puv880的核心啟動(dòng)子序列不超過(guò)444bp。結(jié)合生長(zhǎng)速率測(cè)定，推測(cè)啟動(dòng)子puv880與稻曲病菌在不利環(huán)境下的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢有關(guān)，對(duì)解析稻曲病菌形成薄壁分生孢子的分子機(jī)理提供了重要線索。
　　通過(guò)致病性試驗(yàn)，還獲得一個(gè)稻曲病菌致病性喪失突變體B1015。與野生菌株P(guān)1相比，B1015在PSA、TB3及MM培養(yǎng)上生長(zhǎng)速率明顯變慢，在馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PS)上幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，且沒(méi)有分生孢子的產(chǎn)生，

6、推測(cè)T-DNA的插入影響了稻曲病菌生長(zhǎng)相關(guān)基因的功能。利用PCR技術(shù)證實(shí)了T-DNA插入在B1015的基因組中。經(jīng)過(guò)Southern雜交分析證實(shí)T-DNA在B1015基因組中為單拷貝插入。采用hi-TAILPCR技術(shù)得到了T-DNA側(cè)翼兩端稻曲病菌突變體B1015上各247bp（U.vRB）和309bp(U.vLB)長(zhǎng)的序列。依據(jù)U.vRB和U.vLB序列設(shè)計(jì)引物F1、R1，以突變體B1015基因組DNA為模板擴(kuò)增后經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)T-DNA