人誘導性多能干細胞人源化培養(yǎng)體系的建立和研究.pdf

1、誘導性多能干細胞（Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）是近年來干細胞研究領域中具有里程碑意義的突破。由體細胞重編程而來的hiPSC為獲得與患者自身遺傳背景一致的多能干細胞增加了一個新途徑，是再生醫(yī)學和組織工程、疾病模型、藥物篩選的理想種子細胞，具有廣闊的臨床應用前景。而hiPSC體外培養(yǎng)條件是否合適則是決定其是否具有應用前景的前提，因此也是研究者關注的熱點。
　　hiPSC的培養(yǎng)包括了體細胞重編程

2、為hiPSC的過程（稱為hiPSC的誘導培養(yǎng)）和hiPSC的擴增培養(yǎng)兩個過程?！昂线m”或者“理想”的hiPSC的培養(yǎng)條件不僅要在擴增培養(yǎng)時維持hiPSC的生物學特性、符合臨床應用前景，還包括這種培養(yǎng)條件是否可同時支持體細胞重編程。目前主要使用小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse EmbryonicFibroblast，MEF)作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的培養(yǎng)，但是這種含有鼠源性細胞的培養(yǎng)體系含有許多潛在的微生物感染風險，并且不可避免的帶有異源細

3、胞和蛋白，限制了hiPSC潛在的臨床應用價值。因此，仍有待進一步探索“合適”或者“理想”的hiPSC誘導和擴增培養(yǎng)條件。我們關注于用人源性細胞作為滋養(yǎng)層用于hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng)。
　　第1章、人骨髓間充質干細胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC方法的建立和研究
　　人間充質干細胞（human Mesenchymal Stem Cell，hMSC）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，可以從少量的骨髓或其他許多組織樣本中分離獲得，可

4、在體外擴增培養(yǎng)，并具有低免疫原性等特征，已被證實可以作為滋養(yǎng)層支持hESC的擴增培養(yǎng)，因此可能是一種理想的hiPSC培養(yǎng)人源性細胞滋養(yǎng)層的選擇。
　　我們創(chuàng)新性地建立一種用hMSC作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC的方法(專利申請?zhí)?201110036898.4)。我們用來自三個健康供者（hMSC1，女性，21歲;hMSC2，女性，45歲;hMSC3，男性，39歲）骨髓的hMSC作為滋養(yǎng)層，發(fā)現其均可支持人包皮成纖維細胞（human for

5、eskin fibroblast，HFF）重編程。HFF轉導攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉錄因子的逆轉錄病毒后，在hMSC滋養(yǎng)層的支持下，約3周以后形成類hESC克隆。這些克隆挑選后可繼續(xù)在hMSC滋養(yǎng)層上擴增，形成典型的hESC形態(tài)。
　　我們檢測了其中兩個hiPSC克隆的特性，免疫熒光檢測結果顯示這些在hMSC滋養(yǎng)層上培養(yǎng)的hiPSC表達未分化hESC特有的表面標記，如AP、SSEA-3、SSEA-4、TRA

6、-1-60、TRA-1-81和NANOG; RT-PCR檢測顯示內源性KLF4、SOX2、c-Myc、OCT4在這些hiPSC上均被激活，并表達NANOG、DNMT3B、 DPPA4、hTERT、NODAL、REX1和TDGF1等多個多潛能基因;EB分化實驗和畸胎瘤形成實驗顯示其在體內外均可形成典型的三胚層組織，具有向三胚層分化的潛能;此外，培養(yǎng)14代以上后，標準G-帶核型分析實驗顯示這兩個hiPSC克隆的核型均為46，XY，提示hiP

7、SC在hMSC滋養(yǎng)層上擴增培養(yǎng)后仍維持正常核型。
　　本研究首次證實了來自不同健康供者的hMS可作為滋養(yǎng)層支持人成纖維細胞的重編程和擴增培養(yǎng)獲得的hiPSC，建立了一種hiPSC人源化培養(yǎng)體系，為建立符合臨床應用需要的hiPSC的培養(yǎng)方法提供了一種可行途徑。
　　第2章、自身成纖維細胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC方法的建立和研究
　　我們在研究人成纖維細胞重編程的過程中觀察到，轉導逆轉錄病毒后，大部分成纖維細胞形態(tài)上并沒有

8、發(fā)生改變，且仍具有較強的增殖能力。而MEF滋養(yǎng)層因滅活處理，喪失增殖能力。在將轉導了病毒的成纖維接種到MEF滋養(yǎng)層上一周以后，培養(yǎng)體系中幾乎全部是成纖維細胞，觀察不到MEF滋養(yǎng)層的存在。我們推測重編程過程的后期，可能主要由大部分沒有發(fā)生重編程的成纖維細胞支持小部分成纖維細胞重編程。因此，我們研究了自身成纖維細胞是否可作為滋養(yǎng)層支持hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng)，并研究以自身成纖維為滋養(yǎng)層誘導培養(yǎng)的hiPSC的生物學特征。
　　我們從兩

9、個需做包皮環(huán)切術兒童手術后廢棄的包皮中分離到兩株包皮成纖維細胞，對二者均進行了相關研究。將HFF轉導攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc轉錄因子的逆轉錄病毒后，不再作消化收集，而是在原來的體系中用hiPSC培養(yǎng)液一直培養(yǎng)。我們觀察到，轉導病毒后，大部分的成纖維細胞形態(tài)上并沒有發(fā)生改變，且仍具有較強的增殖能力。9-10天后，小部分成纖維細胞聚集成小簇，細胞形態(tài)變短變寬，向上皮樣轉變，核仁明顯。約3周后，部分小簇形成較大致密的克隆

10、樣細胞團塊。這些克隆挑選后可繼續(xù)在自身HFF滋養(yǎng)層上擴增，形成典型的hESC形態(tài)。表明在重編程過程中，未發(fā)生有效重編程的自身成纖維細胞可以作為滋養(yǎng)層支持其他成纖維細胞的重編程。
　　我們主要檢測了擴增后其中一個克隆的特性，免疫熒光檢測結果顯示這些在自身HFF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)的hiPSC表達未分化hESC特有的表面標記，如SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG; RT-PCR檢測顯示內源性KLF4、SOX2、c-M

11、yc、OCT4在這些hiPSC上均被激活，并表達NANOG、DNMT3B、hTERT、DPPA4和NODAL等多個多潛能基因;EB分化實驗和畸胎瘤形成實驗顯示其在體內外均可形成典型的三胚層組織，具有向三胚層分化的潛能;此外，培養(yǎng)21代以上后，標準G-帶核型分析實驗顯示這兩個hiPSC克隆的核型均為46，XY，提示hiPSC在自身HFF滋養(yǎng)層上擴增培養(yǎng)后仍維持正常核型。
　　本研究首次證實了轉導了攜帶有Klf4、Sox2、Oct4和

12、c-Myc轉錄因子的逆轉錄病毒后，未發(fā)生重編程的自身HFF可支持小部分HFF發(fā)生重編程。建立了一種用自身HFF支持hiPSC的誘導和擴增培養(yǎng)的人源化培養(yǎng)體系，為建立符合臨床應用需要的hiPSC的培養(yǎng)方法提供了另一種更具有優(yōu)勢的可行途徑，也為研究人成纖維細胞重編程機制提供了一個很好的模型。
　　第3章、不同滋養(yǎng)層對重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能影響的研究
　　培養(yǎng)微環(huán)境涉及細胞、細胞外基質、細胞因子等各種成分

13、，通過多種途徑影響體細胞重編程和多能干細胞的生物學特征。其中滋養(yǎng)層細胞在培養(yǎng)微環(huán)境中起復雜而重要的作用。我們在研究用hMSC和自身HFF作為滋養(yǎng)層支持成纖維細胞的重編程和培養(yǎng)獲得的hiPSC時，發(fā)現不同的滋養(yǎng)層對體細胞重編程效率和hiPSC自我更新能力、多向分化潛能均具有較明顯的影響。
　　我們比較了不同滋養(yǎng)層對成纖維細胞重編程效率的影響。通過三次重復實驗，我們發(fā)現，HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiP

14、SC的效率分別是在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程效率的7.26％±2.09％(P＜0.05)、37.08％±5.63％(P＜0.05)。為了進一步明確導致這種差異的原因，我們用MEF條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，但是HFF在以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并未提高（分別為8.52％±5.4％，35.98％±7.82％），仍然明顯低于其在以MEF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的重編程效率。
　　此外，我們檢測了hiPS

15、C克隆在hMSC、HFF、MEF這三種類型滋養(yǎng)層上的增殖情況，發(fā)現其平均擴增倍數分別為2.31±0.12(P＜0.05)、2.66±0.17(P＜0.05)、4.77±0.64。同時，我們發(fā)現以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC傳代后培養(yǎng)至第5天時，大部分克隆仍維持未分化狀態(tài)（未分化克隆占97.3％±1.15％）;至第7天時，出現小部分分化的克?。ㄎ捶只寺≌?6.7％±6.81％）。而以hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC培養(yǎng)至第

16、5天時，分化的克隆即明顯增多（未分化克隆分別占77.3％±10.1％、80.7％±5.13％，P＜0.05）;至第7天時，分化的克隆進一步增多（未分化克隆分別占64.3％±4.93％、67.3％±6.51％，P＜0.05）。通過流式檢測，我們發(fā)現在hMSC、自身HFF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)7天后的hiPSC克隆中TRA-1-60陽性細胞比例（分別為75.6％±3.35％、74.9％±4.72％）均低于以MEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)的hiPSC克隆中TRA-

17、1-60陽性細胞比例。
　　本研究首次比較了不同滋養(yǎng)層對人成纖維細胞重編程效率的影響，發(fā)現在相同條件下，體細胞在人源性細胞滋養(yǎng)層上發(fā)生重編程的效率明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的重編程效率。但是，即使使用了MEF條件培養(yǎng)液，成纖維細胞在以hMSC、HFF為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中重編程為hiPSC的效率并未提高。同樣，用hMSC、HFF作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)hiPSC時，hiPSC的增殖能力明顯低于其在MEF滋養(yǎng)層上的增殖能力，且更易分化。需要進一