RUNX3對人胃癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)的影響分子機制研究.pdf

1、胃癌是目前人類最常見的惡性腫瘤，其死亡率占腫瘤相關(guān)死亡率的第二位。在我國，胃癌發(fā)病率高，預(yù)后差，導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因是術(shù)后發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，因此研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子及其分子機制具有重要的理論價值和臨床意義。
　　 惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展過程是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)性病灶處分離，侵入周圍組織，穿透基底膜進入血管和淋巴管，滲出血管和淋巴管，重新形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進而增殖成新的轉(zhuǎn)移灶，在此過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(E

2、MT)和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)變(MET)起到了關(guān)鍵的作用。EMT在胚胎發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)，后來在眾多腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)現(xiàn)EMT的發(fā)生。EMT在正常胚胎發(fā)育過程中是受到時間和空間上嚴(yán)密調(diào)控的生物學(xué)過程，但在腫瘤中EMT的失調(diào)導(dǎo)致了上皮細胞失去了應(yīng)有表型，獲得了間質(zhì)細胞的特性，從而引起了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，此過程中上皮標(biāo)志性分子鈣粘蛋白E-cadherin表達降低，間質(zhì)標(biāo)志性分子波形蛋白Vimentin表達上升。臨床上胃癌發(fā)展過程中極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，

3、治療和預(yù)后情況極差，所以研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的相關(guān)分子機制是診斷和治療胃癌的重要基礎(chǔ)。
　　 RUNX3是RUNX蛋白家族成員之一，RUNX3在胚胎發(fā)育過程中主要參與胃腸道的發(fā)育，神經(jīng)發(fā)生等活動，近些年來研究發(fā)現(xiàn)RUNX3表達異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Qing-LinLi等發(fā)現(xiàn)RUNX3可以通過對胃粘膜上皮細胞增殖的抑制，促進胃粘膜上皮細胞凋亡和細胞周期的停滯來調(diào)控胃粘膜上皮細胞的生長。臨床研究顯示:RUNX3也與胃癌的

4、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但關(guān)于RUNX3影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制還不完全清楚，RUNX3能否通過調(diào)控EMT影響胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移目前還未見報道。本研究探討了腫瘤抑制因子RUNX3對人胃癌細胞EMT的影響及分子調(diào)控機制。
　　 第一部分:RUNX3對人胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　 目的:探討RUNX3對人胃癌細胞BGC823及SGC7901侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法:將RUNX3的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細胞SGC7901及B

5、GC82348h后，一部分細胞提RNA和蛋白，做QRT-PCR和Westernblotting。另一部分細胞消化、計數(shù)，小室預(yù)鋪matrigel膠，取五萬個細胞加入Transwell小室的上層，下層加入NTH3T3細胞培養(yǎng)液，24小時后，移去上層未侵襲的細胞，穿過的細胞甲醇固定后結(jié)晶紫染色并細胞計數(shù)。
　　 結(jié)果:QRT-PCR和Westernblotting顯示在人胃癌細胞BGC823和SGC7901中RUNX3基因顯著高表達

6、，Transwell實驗中RUNX3高表達組相對于對照組侵襲到下層的細胞數(shù)顯著性減少。
　　 結(jié)論:轉(zhuǎn)染后RUNX3真核表達質(zhì)粒成功高表達RUNX3蛋白。
　　 Transwell實驗表明在胃癌細胞系中高表達RUNX3組相對于對照組可以明顯抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移性。
　　 第二部分:RUNX3對EMT相關(guān)基因表達的調(diào)控
　　 目的:探討RUNX3對EMT相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、Snai

7、l及Twist表達的影響。
　　 方法:將RUNX3的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA和提取蛋白，Westernblotting及RT-PCR、QRT-PCR檢測RUNX3對E-cadherin、Vimentin、Snail及Twist表達的影響，穩(wěn)定特異性siRNA干擾RUNX3的表達72小時后，檢測E-cadherin及Vimentin的表達。
　　 結(jié)果:RUNX3表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC790

8、1后，Westernblotting顯示E-cadherin的蛋白水平有所升高，但不太明顯，Vimcntin的蛋白水平顯著降低。將RUNX3用siRNA干擾后，Vimentin的蛋白水平明顯升高，RT-PCR和QRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Runx3對E-cadherin和Vimentin的RNA水平?jīng)]有顯著影響。高表達RUNX3后Snail和Twist等調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子在蛋白和RNA水平上均沒有什么變化。
　　 結(jié)論:高表達R

9、UNX3只在蛋白水平上能夠輕微升高E-cadherin的表達，顯著抑制Vimentin的表達，沉默RUNX3后Vimentin顯著升高，但是RUNX3對EMT的調(diào)控作用與Snail和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控?zé)o關(guān)，并且是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用方式。
　　 第三部分:Runx3調(diào)控Vimentin基因表達的分子機制
　　 目的:探討RUNX3對Vimentin基因的表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機制
　　 方法:轉(zhuǎn)染RUN

10、X3表達質(zhì)粒后42h后，加入10μM的MG-132，作用6h后，提取蛋白，Westernboltting檢測Vimentin表達的情況，另外轉(zhuǎn)染RUNX3表達質(zhì)粒后做microRNA基因芯片篩查，對篩查結(jié)果進行查閱文獻和microRNA數(shù)據(jù)庫比對分析。
　　 結(jié)果:加入蛋白酶體抑制劑MG-132后Vimentin的表達水平并沒有恢復(fù)。microRNA芯片結(jié)果顯示RUNX3可以顯著上調(diào)miR-30a的表達，查閱文獻和microRN

11、A數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-30a可以不完全互補結(jié)合在Vimentin基因的3'-UTR區(qū)，抑制Vimentin蛋白的翻譯過程。
　　 結(jié)論:Runx3調(diào)控Vimentin的表達不是通過泛素-蛋白酶體途徑實現(xiàn)的，芯片結(jié)果顯示RUNX3可以上調(diào)miR-30a的表達，數(shù)據(jù)庫和文獻顯示miR-30a可以抑制Vimentin蛋白的轉(zhuǎn)錄后表達，從而說明RUNX3可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Vimentin蛋白的表達。
　　 第四部分:RUNX3通

12、過miR-30a調(diào)控Vimentin基因表達影響EMT的發(fā)生
　　 目的:驗證RUNX3通過上調(diào)miR-30a從而抑制Vimentin基因的轉(zhuǎn)錄后表達這一分子機制。
　　 方法:轉(zhuǎn)染RUNX3表達質(zhì)粒48h和siRNA干擾RUNX372h后，Trizol法提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，QRT-PCR檢測miR-30家族的表達情況，miR-30家族mimics轉(zhuǎn)染胃癌細胞后提取蛋白，Westernboltting檢測Vime

13、ntin表達的情況。通過分子克隆構(gòu)建了Vimentin的mRNA的3'UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒的野生型和突變型pMIR-Vimentin3'UTR,pMIR-Vimentin3'UTRMUT1和pMIR-Vimentin3'UTRMUT2，轉(zhuǎn)染miR-30a24h后轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒，48h后進行熒光素酶檢測。
　　 結(jié)果:QRT-PCR結(jié)果證實:高表達RUNX3確實可以顯著升高miR-30a的水平，干擾RUNX3表達可以抑制miR-

14、30a的表達。RUNX3的變化對miR-30e沒有顯著性影響。miR-30amimics轉(zhuǎn)染胃癌細胞后Vimentin的表達水平顯著降低，和轉(zhuǎn)染RUNX3表達質(zhì)粒的效果一致。miR-30e對Vimentin蛋白表達沒有影響。熒光素酶實驗顯示相對于轉(zhuǎn)染miR-1011，野生型和Mutl突變報告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染miR-30a熒光素酶表達值降低，Mut2突變報告系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染miR-30a熒光素酶值恢復(fù)到對照組的水平。
　　 結(jié)論:RUNX3確

15、實可以顯著正性調(diào)控miR-30a的表達，但對miR-30e的調(diào)控不明顯，miR-30a可以靶向結(jié)合到Vimentin的3'UTR上的第二個結(jié)合位點上，抑制Vimentin的mRNA的翻譯，降低Vimentin蛋白的表達。腫瘤抑制因子RUNX3影響EMT的分子機制是RUNX3可以上調(diào)miR-30a的表達從而間接抑制了Vimentin的表達水平。
　　 研究創(chuàng)新性和意義
　　 腫瘤抑制因子RUNX3與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)

16、性，本研究在細胞水平上首次揭示了在人胃癌細胞中RUNX3可以影響轉(zhuǎn)移過程中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)現(xiàn)象，并且證明RUNX3可以通過上調(diào)miR-30a的表達，miR-30a又通過靶向結(jié)合Vimentin的3，UTR，從而抑制EMT中關(guān)鍵的間質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin的表達，從而起到抑制EMT的發(fā)生和胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。通過此研究在RUNX3與EMT之間的關(guān)系上發(fā)現(xiàn)一個重要通路，并且在分子標(biāo)志物方面對于胃癌的臨床診斷和治療提供重要的分子