用于核移植表達rHSA嵌合HLA-YAC的山羊胎兒成纖維細胞株的制備.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動物主要用于基因功能研究、人類遺傳病動物模型以及在乳汁中表達重組蛋白,然而常規(guī)載體轉(zhuǎn)基因由于受整合位點以及構(gòu)件本身缺陷的影響,表達的不確定性是其主要缺陷,解決的主要途徑之一就是利用具有獨立表達域的基因組大片斷作為表達框架來排除位置效應(yīng).酵母人工染色體(YAC)巨大的克隆能力能滿足這個要求,YAC克隆(YACs)轉(zhuǎn)基因在大部分情況下表現(xiàn)出了位置獨立性、拷貝數(shù)依賴性、組織特異性以及與內(nèi)源性基因相當(dāng)?shù)谋磉_水平.本實驗利用從法國人類多態(tài)性

2、研究中心(CEPH)YAC庫篩選出的含人α-乳白蛋白基因(human α-lactalbumin gene,hα-Lac)的長約210kb的YAC(HLA-YAC),用于在轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中表達人血清白蛋白(human serum albumin,HSA).CEPH YAC庫是用酵母AB1380菌株構(gòu)建的,該菌株缺少可用的遺傳篩選標(biāo)記,這給YACs的遺傳學(xué)操作帶來了難度.為了便于同源重組的篩選,借助YPH925的kar1突變,使YPH92

3、5菌株與異交配型菌株交配時喪失核融合的能力,通過單個染色體在酵母間的轉(zhuǎn)移,在藥物篩選的條件下,把HLA-YAC由酵母AB1380轉(zhuǎn)移到his3缺陷的YPH925菌株,經(jīng)脈沖凝膠電泳和PCR方法證實,YPH925獲得了來自AB1380的HLA-YAC.為了探索用不同的篩選標(biāo)記在酵母中對HLA-YAC定點打靶的可行性,構(gòu)建了包含HIS3(對YPH925菌株)和G418R(對YPH925和AB1380兩種菌株)兩個篩選標(biāo)記,以及hα-Lac的