zVAD-fmk對imDC誘導初始性CD4+T細胞分化為Treg影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　從人外周血中獲得imDC,并與另一個體臍血來源的初始性CD4+T細胞混合培養(yǎng),運用特異性阻斷劑zVAD-fmk阻斷Caspase信號傳導通路,研究Caspase通路在imDC誘導同種異體T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞中的作用,探討免疫耐受可能的分子機制。
　　方法:
　　取健康成年人外周靜脈血50ml,用密度梯度離心法分離PBMC,將分離的單個核細胞培養(yǎng)2h后加入GM-CSF和IL-4誘導、擴增7天,使其轉(zhuǎn)化為i

2、mDC。另取其他健康胎兒臍血10ml,密度梯度離心法分離出單個核細胞,用免疫磁珠分選法從單個核細胞中分離CD4+T細胞,均分為5組細胞:
　　(1)空白組:初始性CD4+T細胞加入等容量RPMI-1640單獨培養(yǎng);
　　(2)混合對照組:imDC與初始性CD4+T細胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng),不加其他試劑,誘導Treg;
　　(3)低濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性CD4+T細胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)

3、同時加入終濃度為10μmol/L的zVAD-fmk;
　　(4)中濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性 CD4+T細胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)同時加入終濃度為20μmol/L的zVAD-fmk;
　　(5)高濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性CD4+T細胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)同時加入終濃度為30μmol/L的zVAD-fmk。再進行混合培養(yǎng)5天,以流式細胞儀檢測CD4+CD25+T細胞(Treg細胞)轉(zhuǎn)

4、化率。
　　結(jié)果:
　　(1)、imDC的鑒定:形態(tài)學方面:培養(yǎng)至第七天的PBMC懸浮生長,表面可見毛刺狀突起,體積較前增大,鏡下觀察:成簇的細胞團散開,形態(tài)不規(guī)則的貼壁細胞減少。經(jīng)誘導后,流式細胞儀檢測細胞表面分子。
　　(2)、混合培養(yǎng)后以FCM檢測T細胞轉(zhuǎn)化率,T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細胞的轉(zhuǎn)化率結(jié)果為:空白組:1.78±0.11、混合對照組:22.23±0.77、低濃度zVAD-fmk組:21.63±0

5、.82、中濃度zVAD-fmk組:12.24±0.54、高濃度zVAD-fmk組:12.20±0.96、,除混合對照組和低濃度組、中濃度組和高濃度組之間外,各組間 P值<0.05,差異有顯著性。結(jié)果說明:加入zVAD-fmk并與imDC細胞混合培養(yǎng)的T細胞轉(zhuǎn)化率相對于未加入阻斷劑的T細胞較低,同時Caspase信號通路對zVAD-fmk無濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　(1)、通過應用rhGM-CSF+rhIL-4聯(lián)合誘導PB