利用條件基因剔除技術(shù)研究Smad4基因在軟骨內(nèi)成骨過程中的功能.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所博士學位論文利用條件基因剔除技術(shù)研究Smad4基因在軟骨內(nèi)成骨過程中的功能姓名：張繼帥申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：楊曉20040517摘要分子可以促進靜止軟骨細胞分化，刺激增殖軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞肥大分化，并提示Smad4介導的信號可能作為調(diào)控生長板軟骨細胞極，K排列的形態(tài)發(fā)生素維持生長板軟骨的正常組織結(jié)構(gòu)。我們還研究了阻斷Smad4介導的BMP、TGF一6信號對其它調(diào)控骨骼發(fā)

2、育過程的關(guān)鍵信號通路的影響。原位雜交和免疫組化結(jié)果顯示，Smad4基因剔除導致Ihh、Ptc、PTHrP、PPR基因的表達顯著降低，提示基因剔除小鼠中Ihl，PTHrP信號通路的功能減弱。研究還發(fā)現(xiàn)Smad4基因剔除導致了FGF信號的功能相對增強，生長板軟骨細胞p21分子表達水平升高以及STAT一1分子主要位于細胞核內(nèi)。利用VonKossa染色觀察小鼠骨骼礦化情況，發(fā)現(xiàn)基因剔除小鼠的骨領(lǐng)位置較高，緊鄰增殖區(qū)軟骨細胞。原位雜交檢測成骨細胞

3、的標志分子骨橋素和骨鈣素，發(fā)現(xiàn)它們的表達位置比它們在對照小鼠的表達位置升高。這些結(jié)果表明基因剔除小鼠中軟骨膜細胞提前分化為成骨細胞。為了驗證Smad4介導的信號是否直接通過調(diào)節(jié)IhlVPTHrP信號通路控制軟骨細胞的肥大分化，我們進行了胚胎期跖骨體外培養(yǎng)實驗。結(jié)果顯示Smad4基因剔除的跖骨失去了對BMP和TGFB信號的反應(yīng)，但仍能應(yīng)答Ihh替代分子Shh的作用，對照和基因剔除跖骨軟骨細胞的肥大分化均受到Shh的明顯抑制。這些結(jié)果表明基

4、因剔除小鼠中Ihh／PTHrP信號通路的功能『F常，Smad4抑制軟骨細胞肥大分化的作用不依賴于Ihth／PTHrP信號通路。我們的實驗結(jié)果首次提供體內(nèi)的遺傳學證據(jù)證明Smad4分子是維持生長板軟骨『F常組織結(jié)構(gòu)所必需的。Smad4介導的信號促進靜止軟骨細胞分化，刺激增殖軟骨細胞增殖，不依賴于Ihh／PTHrP信號通路抑制軟骨細胞肥大分化。軟骨組織特異性Smad4基因剔除小鼠的成功研制為進一步深入研究Smad4介導的TGF—B信號在軟骨