AT1-R在雌激素誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖中的作用.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的健康。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制十分復雜，高水平雌激素長期刺激與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病關系密切，AT1-R子宮內(nèi)膜癌中存在過表達，為此探討AT1-R在雌激素誘導子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A增殖、細胞周期轉化中的作用及其對ERK1/2表達的影響。
　　 本實驗采用免疫熒光技術檢測AT1-R在HEC-1A細胞中的表達；脂質體介導AT1-R-siRNA質粒轉染人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A，

2、經(jīng)G418選擇培養(yǎng)，采用Westernblot檢測轉染前后HEC-1A細胞中AT1-R蛋白的表達。MTT法檢測無雌激素誘導及雌激素誘導10min轉染前后細胞的增殖；流式細胞技術檢測細胞周期；Western blot檢測ERK1/2蛋白及ER蛋白表達水平。
　　 材料和方法:
　　 一、材料
　　 1、細胞系 ER低表達人子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A購自中國科學院上海生命科學研究院。
　　 2、試劑水溶性1

3、7β-雌二醇、四甲基亞唑藍(MTT)和碘化丙啶購自美國Sigma公司，AT1-R-siRNA由上海吉凱基因化學技術有限公司合成并進行熒光標記(AT1-RsiRNA正義鏈：5′GTATGCCTTCCTGTTTAAA3′)，LipofectamineTM2000購自invitrogen公司，G418購自德國merck公司。
　　 二、實驗方法
　　 免疫熒光技術檢測AT1-R在HEC-1A細胞中的表達；脂質體介導AT1-R-

4、siRNA質粒轉染人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)，采用Western blot檢測轉染前后HEC-1A細胞中AT1-R蛋白的表達。MTT法檢測無雌激素誘導及雌激素誘導10min轉染前后細胞的增殖；流式細胞技術檢測細胞周期；Western blot檢測ERK1/2蛋白及ER蛋白表達水平。
　　 三、統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差((x)±S)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P＜

5、0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、免疫熒光實驗證實AT1-R表達于HEC-1A細胞膜和細胞質中。
　　 2、轉染AT1-R-siRNA-GFP48h后在熒光顯微鏡下觀察，可見部分細胞呈綠色熒光，表示siRNA已成功轉染入HEC-1A細胞。經(jīng)G418篩選后擴大培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代兩個月，獲得穩(wěn)定的細胞克隆HEC-1A-siRNA。
　　 3、Western blot檢測轉染組HEC-1A-s

6、iRNA細胞AT1-R蛋白表達水平較未轉染組明顯降低，AT1-R蛋白表達的抑制率為41.79％。
　　 4、MTT檢測17β-E2作用10min能夠誘導HEC-1A細胞增殖，其增殖率為14.74％，AT1-R沉默后再用雌激素誘導，HEC-1A細胞增殖受到明顯抑制，其抑制率為29.34％。
　　 5、雌激素誘導10min能使HEC-1A細胞G1期細胞減少，S期細胞增多；AT1-R沉默后再用雌激素作用10min，與未轉染雌激

7、素作用組相比，E2促進HEC-1A細胞周期轉化作用受到明顯抑制，G1期細胞增加，S期細胞減少。
　　 6、雌激素誘導10min后，HEC-1A細胞ERK1/2蛋白表達水平升高；AT1-R沉默后再用雌激素誘導10min，ERK1/2蛋白表達較未轉染雌激素作用組顯著降低。
　　 7、雌激素誘導10min后，HEC-1A細胞ER蛋白表達無明顯變化；AT1-R沉默后再用雌激素誘導10min，ER蛋白表達也沒有受到抑制。